丙戊酸鈉對肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力的影響

代麗麗，束 軍, 朱 寧，張 梅，沈繼龍

癌細(xì)胞在有氧條件下能加速葡萄糖消耗，增加乳酸積累，這種現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解[1]，可刺激關(guān)鍵酶如乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)等的合成增加，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了異常的LDH表達(dá)[2-5]，抑制LDH可以抑制腫瘤的進(jìn)展[4，6]。丙戊酸鈉(sodium valproate,VPA)在多種癌癥中發(fā)揮抗癌作用,VPA可抑制肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[7]，VPA通過抑制有氧糖酵解抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展[8]，然而，VPA與肺腺癌PC9細(xì)胞的研究鮮有報(bào)道，與其有氧糖酵解及EMT的關(guān)系尚不清楚，該實(shí)驗(yàn)旨在研究VPA是否能抑制PC9細(xì)胞的增殖遷移能力及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器人肺腺癌PC9細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院；酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Biotek公司；VPA購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒(c0039)、胰酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；DMEM低糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；LDH試劑盒(A020-1-2)、LD試劑盒(A019-2)購自南京建成生物工程研究所;人E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)ELISA 試劑盒(CSB-E04519h)、人波形蛋白(vimentin，VIM)ELISA 試劑盒(CSB-E08982h)購自武漢華美生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用DMEM低糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人肺腺癌PC9細(xì)胞，用37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，胎牛血清的濃度為10%，細(xì)胞呈貼壁生長，每2～3 d傳代1次。

1.2.2CCK-8法檢測VPA對PC9細(xì)胞增殖能力的影響 待細(xì)胞密度達(dá)到5×104個/ml時，在96孔培養(yǎng)板的每孔中加入100 μl細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后，加入2 ml含不同濃度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個復(fù)孔。分別作用24、48 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，調(diào)整酶聯(lián)免疫檢測儀波長為450 nm,分別于0.5、1、2、3、4 h檢測吸光度(optical density，OD)值。計(jì)算各組增殖抑制率，抑制率(%)=[1-實(shí)驗(yàn)組OD值]/對照組OD值×100%，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測VPA對PC9細(xì)胞體外遷移能力的影響 在6孔板背面每隔0.5～1 cm劃一條橫線，加入PC9細(xì)胞，待細(xì)胞長滿時用200 μl槍頭垂直于橫線劃痕。棄原培養(yǎng)基后，加無血清的培養(yǎng)基，使用顯微鏡拍照，為0 h的劃痕寬度，棄無血清培養(yǎng)基，加入2 ml含不同濃度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)的培養(yǎng)基，24 h后使用倒置顯微鏡在和0 h拍照位置同樣的位置拍照，用Image-pro plus 6.0軟件計(jì)算遷移距離，遷移距離=0 h距離-24 h距離。

1.2.4乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒檢測VPA對LDH活性的影響 將PC9細(xì)胞接種于6孔板，濃度調(diào)整為2×105個/ml，待細(xì)胞密度約60%～70%后，棄原培養(yǎng)基，加入2 ml含不同濃度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)的培養(yǎng)基，24 h后棄去培養(yǎng)液，消化離心，將離心后的細(xì)胞加入裂解液，室溫放置1 h后將其置于-80 ℃冰箱15 min，后迅速放入37 ℃水浴鍋5 min，反復(fù)操作3次。后放入離心機(jī)離心，將上清液移至EP管中備用。按照LDH測試盒說明書中的操作步驟分別進(jìn)行加樣后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長為440 nm時測定OD值，計(jì)算出LDH活性，計(jì)算公式為：LDH活性=(測定OD值-對照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(2 mmol/L)×N×1 000(N為樣本稀釋倍數(shù))。

1.2.5乳酸定量試劑盒檢測VPA對LD生成量的影響 將PC9細(xì)胞接種于6孔板，濃度為2×105個/ml，待細(xì)胞貼壁密度60%～70%后，棄原培養(yǎng)基，加入2 ml含不同濃度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)的培養(yǎng)基，24 h后，將上清液離心，離心機(jī)參數(shù)為4 ℃、3 000 r/min，離心20 min，將上清液備用。按照LD測試盒說明書中的操作步驟分別進(jìn)行加樣后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長為530 nm時測定OD值，計(jì)算出LD生成量，計(jì)算公式為：培養(yǎng)液中的乳酸含量(mmol/L)=(測定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(3 mmol/L)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.2.6人E-cad及VIM酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測細(xì)胞上清液及細(xì)胞內(nèi)E-cad及VIM的濃度 按1.2.4及1.2.5方法制備待測樣本后，按照酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行操作后用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm 波長依序測量各孔的OD 值，計(jì)算出蛋白含量，計(jì)算方法為：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 VPA抑制PC9細(xì)胞的增殖CCK-8法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的VPA分別干預(yù)24、48 h后，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在同樣的作用時間，VPA濃度越大，其對PC9細(xì)胞的增殖抑制率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在同樣濃度的VPA作用下，VPA作用時間越長，其對PC9細(xì)胞的增殖抑制率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24 h時(F=162，P<0.05)；48h時(F=145，P<0.05)。綜上，VPA對PC9細(xì)胞的增殖抑制作用有濃度依賴性和時間依賴性，見圖1。

圖1 VPA對PC9細(xì)胞抑制率的影響

與0 mmol/L對照組比較：*P<0.05；與2 mmol/L實(shí)驗(yàn)組比較：#P<0.05；與4 mmol/L實(shí)驗(yàn)組比較：&P<0.05；與8mmol/L實(shí)驗(yàn)組比較:★P<0.05；與24 h比較：▲P<0.05

2.2 VPA抑制PC9細(xì)胞的遷移與對照組比較，VPA濃度越高，遷移距離越少，各實(shí)驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=133，P<0.05)，見圖2。

2.3 VPA抑制LDH活性不同濃度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)作用24 h后，VPA濃度越高，LDH活性越低，0、2、4、8、16 mmol/L每兩組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=157，P<0.05)。見表1。

2.4 VPA抑制LD生成不同濃度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)作用于細(xì)胞24 h后，VPA濃度越高，乳酸生成量越低，0、2、4、8、16 mmol/L每兩組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=289，P<0.05)。見表1。

圖2 VPA對PC9細(xì)胞遷移能力的影響 ×100

A：對照組；B～E： VPA 2、4、8、16 mmol/L；1：0 h；2：24 h；與0 mmol/L對照組比較：*P<0.05；與2 mmol/L實(shí)驗(yàn)組比較：#P<0.05；與4 mmol/L實(shí)驗(yàn)組比較：&P<0.05；與8 mmol/L實(shí)驗(yàn)組比較:★P<0.05

表1 不同濃度的VPA分別干預(yù)PC9細(xì)胞對其LDH活性、LD生成量、上清液及細(xì)胞內(nèi)E-cad、VIM的影響

與0 mmol/L對照組比較：*P<0.05；與2 mmol/L實(shí)驗(yàn)組比較：#P<0.05；與4 mmol/L實(shí)驗(yàn)組比較：&P<0.05；與8 mmol/L實(shí)驗(yàn)組比較:★P<0.05；與上清液中E-cad含量比較：■P<0.05;與上清液中VIM含量比較：▲P<0.05

2.5 VPA促進(jìn)E-cad生成不同濃度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)作用于細(xì)胞24 h后，VPA濃度越高，E-cad含量越高，0、2、4、8、16 mmol/L每兩組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，上清液中E-cad含量(F=235，P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)E-cad含量(F=268，P<0.05)。見表1。

2.6 VPA抑制VIM生成不同濃度的VPA(0、2、4、8、16 mmol/L)作用于細(xì)胞24 h后，VPA濃度越高，VIM含量越低，0、2、4、8、16 mmol/L每兩組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，上清液中VIM含量(F=180，P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)VIM含量(F=149，P<0.05)，見表1。

3 討論

在所有癌癥中，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居前列。在2019年180萬新發(fā)癌癥病例中，肺癌占12.9%，占癌癥相關(guān)死亡病例的19.4%[9]。既往已有的治療方式很多，但患者的預(yù)后仍需進(jìn)一步改善。新開發(fā)藥物需要耗費(fèi)很多的財(cái)力和時間，探索已有的藥物是否有抑制腫瘤作用成為一個新的方向。

VPA作為一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACIs)，已被廣泛應(yīng)用于治療癲癇癥等疾病。組蛋白去乙酰化酶通過組蛋白的去乙酰化，使DNA更緊地纏繞在組蛋白上，導(dǎo)致與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期阻滯等蛋白的表達(dá)受到抑制引起癌癥，HDACIs能恢復(fù)這些癌癥抑制因子的表達(dá)達(dá)到抑制腫瘤的目的[10]。VPA可以抑制多種癌癥的發(fā)展，Xu et al[11]證明VPA誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡和自噬，F(xiàn)anian et al[12]證明 VPA通過抑制MMP-2抑制甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，F(xiàn)ang et al[8]證明VPA通過抑制有氧糖酵解抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展。但VPA與PC9的相關(guān)研究目前鮮有報(bào)道，本研究旨在探討不同濃度VPA對肺腺癌PC9細(xì)胞增殖、遷移能力的影響及可能的機(jī)制。結(jié)果表明，不同濃度的VPA可以抑制PC9細(xì)胞的增殖和遷移,VPA濃度越高，抑制作用越明顯，同時與對照組相比，VPA濃度越高，LDH活性及LD生成量越少，說明VPA抑制了有氧糖酵解。VPA對PC9細(xì)胞的增殖和遷移的抑制與對有氧糖酵解的抑制呈現(xiàn)一致性，提示VPA有可能通過抑制有氧糖酵解途徑抑制PC9細(xì)胞的增殖和遷移。

EMT在腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移時發(fā)揮重要的作用，EMT的標(biāo)志物很多，其中上皮標(biāo)志物E-cad和間質(zhì)標(biāo)志物VIM較為典型，發(fā)生EMT時，E-cad含量降低，VIM的含量增高[13]，本研究中，ELISA的結(jié)果表明，隨著VPA濃度增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和細(xì)胞內(nèi)E-cad蛋白濃度均逐漸增高，VIM蛋白濃度均逐漸降低，這表明VPA可以抑制EMT的進(jìn)展，這與許多研究[4，12]結(jié)果相符。

Hou et al[2]在肺癌中檢測到LDH高表達(dá)，敲低肺癌細(xì)胞中的LDH-A可抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲，且敲低前后E-cad的表達(dá)水平上調(diào)，而VIM的表達(dá)水平下調(diào)，證明了LDH可以調(diào)節(jié)EMT，同樣的Jiang et al[4]證明膀胱癌中檢測到LDH高表達(dá)，敲低LDH后，VIM、N-cad、snail下調(diào)，而E-cad上調(diào)，表明抑制LDH抑制EMT，與之一致，由此筆者猜想VPA可能是通過抑制LDH活性來抑制EMT從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移，其中的機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明VPA可以抑制PC9細(xì)胞的增殖、遷移，但是VPA在體內(nèi)的抗腫瘤作用、對正常支氣管上皮細(xì)胞的影響及具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。