白藜蘆醇通過調(diào)控IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

李根林，劉 杰，謝 晶，余芙蓉，胡 意

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中第三常見的癌癥類型，死亡率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中最高，5年生存率僅約30%～ 40%。卵巢癌以腹腔內(nèi)浸潤和轉(zhuǎn)移為特征，晚期臨床常有多處遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。白細(xì)胞介素6(interleukin 6, IL-6)是一種重要的炎癥因子，它與細(xì)胞膜上的IL-6受體結(jié)合，激活多種下游途徑，如JAK2/STAT3和PI3K/AKT途徑。JAK2/STAT3途徑是一種從膜到核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。JAK2蛋白激酶的激活可以催化STAT3蛋白磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)基因和其他基因的表達(dá)[2]。已有研究[3]發(fā)現(xiàn)，IL-6/JAK2/STAT3通路的過度激活可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT。已發(fā)現(xiàn)天然植物提取物對(duì)抗腫瘤具有良好治療功效，且不良反應(yīng)少。白藜蘆醇(resveratrol，Rev)作為典型的天然植物抗毒素，能有效抑制與癌癥生長和進(jìn)展相關(guān)的多種細(xì)胞行為[4]。且該植物抗毒素化合物能通過未知機(jī)制下調(diào)鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug表達(dá)來抑制癌細(xì)胞EMT[5]。故現(xiàn)利用Rev處理卵巢癌SKOV-3細(xì)胞來探討其通過調(diào)控IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞購自北京BNCC；McCOY’S 5A培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰酶均購自美國Gibco公司；結(jié)晶紫染液購自北京Solarbio公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)購自上海碧云天生物技術(shù)公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(B lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2家族促凋亡蛋白(Bcl-2 family apoptotic proteins，Bax)、活化的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved Caspase-3)、鈣黏著蛋白E(Ca2+dependent cell adhesion moleculue family-E，E-cadherin)、N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、IL-6、酪氨酸激酶(tyrosine kinase，JAK2)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT3)、GAPDH一抗以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理將人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞懸浮于含有10%胎牛血清和1%胰島素雙抗的McCOY’S 5A培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞分為人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞空白組(CON組)、白藜蘆醇低濃度(1.0×106mol/L)組(Rev-L組)、 白藜蘆醇中濃度(5.0×106mol/L)組(Rev-M組)、白藜蘆醇高濃度(2.50×105mol/L)組(Rev-H組)[6]。藥物處理24或48 h后，收集各組細(xì)胞待后續(xù)檢測。

1.3 CCK-8法檢測卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的增殖按照每孔2×104個(gè)細(xì)胞將制備好的人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔約100 μl細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。將培養(yǎng)板放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞在培養(yǎng)板上貼壁后，加入含10 % CCK-8的培養(yǎng)基溶液進(jìn)行換液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將培養(yǎng)板取出，測定450 nm波長處的吸光度(optical density, OD)值。藥物處理24 h后檢測1次，藥物處理48 h后檢測1次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的凋亡收集各組細(xì)胞，分別用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，用PBS溶液洗滌2次。在室溫(25 ℃)下用0.25%的含EDTA胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞。收集細(xì)胞培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，再用PBS輕輕懸浮細(xì)胞。將1×106個(gè)細(xì)胞/ml懸浮，300 r/min 離心10 min，在100 μl細(xì)胞懸浮液中加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-FITC，室溫下保持10 min。在室溫下加入5 μl的PI染液保持5 min，再加入500 μl PBS溶液，1 h內(nèi)上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.5 細(xì)胞劃痕法檢測卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的遷移能力在6孔培養(yǎng)板中以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)各組細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)液放置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。再用槍頭比著直尺垂直沿同一方向刮傷，用PBS洗滌細(xì)胞3次，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，在顯微鏡下拍攝結(jié)果照片。

1.6 Transwell法檢測卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的侵襲能力用無血清培養(yǎng)基將預(yù)冷的基底膜稀釋，將稀釋了的基底膜加入Transwell板上室，覆蓋整個(gè)聚碳酯膜，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min使之形成凝膠。在下室中添加750 μl含有10% FBS的DMEM，在上室中添加1×105個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)48 h后，用甲醇固定細(xì)胞，加入0.1%結(jié)晶紫染色10 min，然后用PBS洗滌2次，再用棉球擦去表面細(xì)胞，放在顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot法檢測卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡、遷移以及IL-6/JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白收集每組細(xì)胞，加入裂解液充分裂解后，在4 ℃的離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，取上清液分裝于0.5 ml離心管中。BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。將蛋白質(zhì)樣品(約20 μg)在沸水浴中處理10 min，在常溫離心機(jī)中12 000 r/min 離心5 min后去除上清液。將制備的樣品加入到12%的SDS-PAGE膠中，120 V電泳50 min，直到溴酚藍(lán)接近分離凝膠的底部，完成電泳。再用濕轉(zhuǎn)法將分離出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%BSA封閉液室溫封閉1 h，然后加入一抗Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶500)、E-cadherin(1 ∶500)、N-cadherin(1 ∶1 000)、Vimentin(1 ∶1 000)、IL-6(1 ∶500)、p-JAK2(1 ∶1 000)、p-STAT3(1 ∶2 000)及GAPDH(1 ∶10 000)在4 ℃下封閉過夜。再用Tris-HCl/Tween 20(TBST)沖洗3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體IgG(1 ∶2 000)室溫下孵育1 h，然后用TBST洗滌3次。將膜浸入ECL工作溶液中，2 min后曝光顯色，并放在BIO RAD凝膠成像系統(tǒng)中觀察灰度值，最后計(jì)算所測蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 Rev抑制SKOV-3細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡不同濃度Rev處理SKOV-3細(xì)胞24、48 h后，CCK-8檢測結(jié)果(圖1A)顯示，與CON組比較，24、48 h的Rev-M和Rev-H組的SKOV-3細(xì)胞增殖能力降低(F=62.286，P<0.05；F=126.345，P<0.05)，而Rev-L組與CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.219，P>0.05；t=3.756，P>0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(圖1B)顯示，與CON組比較，Rev-M和Rev-H組的SKOV-3細(xì)胞凋亡比例升高(F=135.400,P<0.05)，而Rev-L組與CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.566，P>0.05)。

2.2 Rev抑制SKOV-3細(xì)胞遷移侵襲能力不同濃度Rev處理SKOV-3細(xì)胞48 h后，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(圖2A)結(jié)果顯示，與CON組比較，Rev-M和Rev-H組SKOV-3細(xì)胞遷移能力下降(F=41.570,P<0.05)，而Rev-L組與CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.844，P>0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)(圖2B)結(jié)果顯示，Rev-M和Rev-H組SKOV-3細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)量低于CON空白組的SKOV-3細(xì)胞(F=36.803,P<0.05)，而Rev-L組的SKOV-3的侵襲細(xì)胞數(shù)量與CON組的細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.815,P>0.05)。

圖1 Rev對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖2 Rev對(duì)SKOV-3細(xì)胞遷移和侵襲的影響 ×200

2.3 Rev上調(diào)Bax及cleaved Caspase-3且下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平不同濃度Rev處理SKOV-3細(xì)胞48 h后，Western blot實(shí)驗(yàn)(圖3)結(jié)果顯示，與CON組比較，Rev-L、Rev-M和Rev-H組SKOV-3細(xì)胞中Bax(F=33.243,P<0.05)及cleaved Caspase-3(F=82.990,P<0.05)促凋亡蛋白表達(dá)水平上升，而Bcl-2(F=43.351,P<0.05)抑凋亡蛋白表達(dá)水平下降。

圖3 Rev對(duì)SKOV-3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

與CON組比較：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.4 Rev上調(diào)SKOV-3細(xì)胞E-cadherin且下調(diào)N-cadherin、Vimentin及β-catenin蛋白表達(dá)水平不同濃度Rev處理SKOV-3細(xì)胞48 h后，Western blot實(shí)驗(yàn)(圖4)結(jié)果顯示，與CON組比較，Rev-L、Rev-M和Rev-H組SKOV-3細(xì)胞中E-cadherin(F=113.902,P<0.05)蛋白表達(dá)水平上升， Rev-M和Rev-H組中N-cadherin(F=40.920,P<0.05)以及Rev-L、Rev-M和Rev-H組中Vimentin(F=87.936,P<0.05)蛋白表達(dá)水平下降，而Rev-L組N-cadherin蛋白與CON組的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.719,P>0.05)。

圖4 Rev對(duì)SKOV-3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響

與CON組比較：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.5 Rev下調(diào)SKOV-3細(xì)胞IL-6/JAK2/STAT3通路蛋白活性不同濃度Rev處理SKOV-3細(xì)胞48 h后，Western blot實(shí)驗(yàn)(圖5)結(jié)果顯示，與CON組比較，Rev-M和Rev-H組SKOV-3細(xì)胞中IL-6(F=106.308,P<0.05)、p-JAK2(F=326.622,P<0.05)及p-STAT3(F=118.054,P<0.05)蛋白表達(dá)水平降低，而Rev-L組SKOV-3細(xì)胞中的通路蛋白IL-6(t=0.995,P>0.05)、p-JAK2(t=1.090,P>0.05)及p-STAT3(t=2.145,P>0.05)蛋白表達(dá)水平與CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

Rev是一種天然的非黃酮類多酚化合物，主要存在于葡萄、藜蘆和日本野雜草等植物中。Rev吸收良好，代謝迅速，主要通過尿液排出。Rev具有多種治療功效，包括抗感染、抗氧化、抗腫瘤、心血管保護(hù)和促進(jìn)生殖功能[7]。據(jù)報(bào)道[8]，Rev通過調(diào)節(jié)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的酶和途徑表現(xiàn)出抗感染活性。一些研究表明，Rev抑制許多癌癥的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，包括乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌。已有的研究[9]表明Rev具有抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移的特性。EMT在腫瘤中通過降低腫瘤細(xì)胞間的黏附性，分泌大量細(xì)胞因子，促使細(xì)胞發(fā)生侵襲和遷移，已被證實(shí)EMT可以增強(qiáng)上皮癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移以及抗凋亡3種惡性潛能[10]。研究[11]顯示，Rev通過下調(diào)EMT轉(zhuǎn)錄因子來抑制各種癌細(xì)胞EMT，如Rev通過降低Snail和Vimentin的表達(dá)來抑制EGF誘導(dǎo)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞EMT。另外Rev也能抑制順鉑處理后的卵巢癌細(xì)胞的EMT[12]。本研究以人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)果表明Rev能抑制卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲，與之前的研究結(jié)果類似。不僅如此，本研究還顯示Rev對(duì)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的增殖凋亡水平有影響，能抑制SKOV-3細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡水平。由此可見Rev對(duì)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的多種生物學(xué)行為的改變起重要作用，但相關(guān)的作用機(jī)制不甚清楚。

圖5 Rev對(duì)SKOV-3細(xì)胞IL-6/T3JAK2/STAT通路蛋白的影響

與CON組比較：*P<0.05,***P<0.001

IL-6是一種由癌相關(guān)成纖維細(xì)胞釋放的促炎細(xì)胞因子，其與卵巢癌細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性行為有關(guān)。IL-6與特定受體復(fù)合物的結(jié)合激活下游激酶的磷酸化和核定位[13]。STAT3被廣泛認(rèn)為是一種能上調(diào)許多增殖或抗凋亡基因(如Cyclind1和Bcl-2)的癌基因，其在促進(jìn)促癌炎癥途徑中具有主導(dǎo)作用[14]。IL-6/JAK2/ STAT3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要調(diào)控意義，而Rev和IL-6以相反的方式影響mRNA的表達(dá)，并參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞外基質(zhì)重塑的miRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲性。因此本研究從IL-6著手，探討IL-6/JAK2/ STAT3信號(hào)通路是否參與Rev對(duì)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。目前的數(shù)據(jù)表明，Rev通過表觀遺傳機(jī)制誘導(dǎo)其抗腫瘤作用，并支持其納入高度侵襲性卵巢癌的化療方案[15]。本研究的細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Rev可以有效抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的遷移和侵襲，并且Rev處理后，SKOV-3細(xì)胞的IL-6、JAK2/STAT3磷酸化水平均受到了抑制，說明Rev可能通過下調(diào)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路活性進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力。

綜上所述，Rev對(duì)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞具有抑制細(xì)胞增殖作用和促細(xì)胞凋亡作用；同時(shí)還能有效抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的遷移和侵襲，這與IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路的失活相關(guān)，具有重要臨床治療意義。