多巴胺修飾表面原位還原納米銀的關鍵影響因素

許克惠， 王 爽， 崔文迪，李嬌嬌，陳佳龍

鈦及其合金廣泛用于牙科種植體和骨科矯形并取得良好的臨床效果，但感染發生率仍較高。材料表面整合納米銀(Nanosilver，AgNPs)，賦予其廣譜抗菌能力，也避免抗生素導致的耐藥菌[1]。近年來，一種簡單而環保的液相多巴胺原位還原納米銀的方法被研究[2-3]，即利用多巴胺的鄰苯二酚與材料表面羥基縮合[4]或金屬配位[5]而結合在材料表面，再螯合溶液中的銀離子并還原，如在鈦金屬[1]、氮化硼納米片[6]、紙[7]的表面沉積多巴胺后，浸泡于銀溶液，獲得載納米銀表面。

目前，多巴胺原位還原納米銀過程中調控因素的系統性研究很少，故研究以多巴胺修飾的多孔鈦作為基材，通過調整硝酸銀溶液的濃度和pH制備出不同的載銀表面，研究各表面理化性能和抗菌性能，為多巴胺介導的納米銀合成提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料純鈦購自山西寶雞有色金屬有限公司；多巴胺、硝酸銀購自美國Sigma Aldrich公司；丙酮、Tris購自上海阿拉丁試劑有限公司；NaoH購自上海國藥集團化學試劑有限公司；腦心浸液肉湯(Brain Heaet Infusion Broth, BHI)購自青島高科園海博生物技術有限公司；活/死細菌染色試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 材料制備及表征將鈦片(直徑為1 cm)依次經過80、150、400、600、800、1 000、1 500、2 000目砂紙打磨后。再依次經過丙酮，無水乙醇，去離子水超聲清洗，標記為Ti。將鈦片浸沒于5 mol/L NaOH溶液中60 ℃處理12 h后，浸入沸水處理2 h，標記為pTi；將pTi浸沒于2 mg/ml的多巴胺溶液中(pH 8.5)，室溫下敞口靜置24 h，去離子水超聲清洗，樣品標記為pTi-Da。將pTi-Da浸沒于不同pH(4、7、10)、不同濃度(2、4、6 mg/ml)硝酸銀溶液中，室溫下反應4 h，去離子水超聲清洗3次，每次30 s，干燥后得到表面沉積納米銀的樣品，總體標記為pTi-Da-Ag。為便于記錄，對不同pH、不同濃度分別標記為pH4/2、pH7/2、pH10/2、pH4/4、pH7/4、pH10/4、pH4/6、pH7/6 和pH10/6。制備過程如圖1所示。

各組選1個樣品干燥后噴金30 s，利用掃描電子顯微鏡(HitachiS-480，SEM)觀察表面形貌的變化。各組選5個樣品，室溫下測量表面水接觸角。各組選1個樣品利用硝酸/鹽酸(1 ∶3)混合液溶解表面的銀，通過電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)測定鈦片表面載銀量。

1.3 抗菌性能評價為評價制備材料的抗菌能力，選擇導致種植體感染的主要細菌(金黃色葡萄球菌)，細菌密度為107CFU/ml進行以下評價。將2 ml菌液加入到放有滅菌樣品的24孔板中，37 ℃培養24 h后，① 每組取出2個樣品，PBS漂洗，采用活/死細菌試劑盒染色 20 min后，熒光顯微鏡下觀察活/死細菌；② 每組取1個孔，吸取10 μl的菌液，PBS稀釋1 000×后，取100 μl涂板，通過涂板法評價材料對溶液中細菌增殖的影響；③ 每組取5個孔，吸取0.2 ml溶液用酶標儀在波長為660 nm下測量吸光度，通過濁度法評價材料抗菌能力；④ 取細菌密度為107CFU/ml的菌液20 μl加入瓊脂培養板并涂布涂勻，然后每組取1個樣品正面向下放置在瓊脂培養基上，37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 樣品表征掃描電子顯微鏡(圖2)展示了各步驟樣品表面形貌的變化。與表面光滑的Ti相比，堿處理后的表面(pTi)具有均勻的多孔形貌，孔徑大小為50～100 nm，并有大量的桿狀物；多巴胺修飾表面(pTi-Da)未有變化；pH 4的3組樣品中，pH4/2表面可見極少量的、粒徑為20 nm左右的球形納米銀(紅圈所示)，pH4/4、pH4/6表面同樣出現少量的球形或多角形納米銀顆粒，粒徑在20～60 nm不等；pH 7的3組樣品中，納米銀的數量有所增加，粒徑分布在20-50 nm，隨著濃度的升高，可見表面納米銀的數量依次增加(pH7/6由于表面顆粒較多，未用紅圈標注)；pH為10的3組樣品表面均有大量的納米銀顆粒，pH10/2表面納米銀粒徑約為20 nm， pH10/4和pH10/6表面納米銀尺寸更加均勻、更小，且數量更多，已經填滿孔洞。以上結果直接證明載銀表面構建成功。

材料表面親水性結果差異具有統計學意義(F=70.52，P=0.00)，見表1，Ti、pTi、pTi-Da的水接觸角分別為(62.40±7.55)°、(10.02±2.74)°、(34.51±4.08)°，組間差異有統計學意義(P<0.01)，說明堿熱活化和多巴胺水相沉積成功實現。pH4/2、pH7/2、pH10/2、pH4/4、pH7/4、pH10/4、pH4/6、pH7/6、pH10/6的水接觸角分別為(22.85±2.61)°、(20.06±2.07)°、(30.97±3.72)°、(22.84±3.41)°、(20.18±2.34)°、(34.20±5.03)°、(24.09±1.50)°、(15.98±1.69)°、(36.31±1.12)°。pH4和7的各組樣品與pTi-Da差異均有顯著性(P<0.01)，而pH10的3組樣品與pTi-Da差異無統計學意義。相同pH下，不同濃度的樣品間，只有pH10/2和pH10/6間差異有統計學意義；相同濃度下，不同pH的樣品組間，pH10與pH4和7差異均有統計學意義(P<0.01)。結果間接證明pH4和pH7下，載銀表面構建成功。

圖2 各樣品的表面形貌 ×100 000

表1 各組樣品靜態水接觸角和24 h細菌增殖結果比較

ICP-AES檢測鈦片表面載銀量，見表2。由表可見，相同pH值下，制備表面的載銀量隨著溶液中硝酸銀的濃度增加而增加，但增幅不大；相同硝酸銀濃度下，制備表面載銀量隨著pH值增加而大幅增加，尤其pH10的處理組的表面載銀量較對應濃度的pH7處理組增加1倍以上。該結果與掃描電鏡結果相吻合。

表2 各鈦片表面含銀總量(μg)

2.2 抗菌評價原位活/死熒光染色法直接檢測材料表面抗菌能力。如圖3所示，Ti、pTi和pTi-Da的表面快速粘附大量細菌且活細菌比例高(綠色)；pH4和pH 7的處理組表面黏附細菌量降低，且死細菌比例(紅色)增加；pH 10的3組樣品黏附細菌量極少，且以死細菌為主，證明該pH值下制備表面抑菌和殺菌性能最佳。

圖3 經活/死細胞熒光染色法各樣品顯微照片,×100

圖中綠色代表活菌，紅色代表死菌；A:Ti; B:pTi; C:pTi-Da; D:pH4/2; E:pH7/2; F:pH10/2; G:pH4/4; H:pH7/4; I:pH10/4;J:pH4/6; K:pH7/6; L:pH10/6

圖4 稀釋涂布平板法結果

涂板法(圖4)直接反映溶液體系中細菌的數量。Ti、pTi、pTi-Da的涂板中已經長滿細菌；pH 4和pH 7的處理組中，細菌數量略有下降；pH10的3組樣品的細菌數量大幅下降，且菌落數量隨著硝酸銀濃度增加而降低，pH10/2菌落均獨立分布，未連成片，pH10/4上零星的幾個菌落，而pH10/6上幾乎看不到菌落，證明堿性環境且高濃度下制備表面的抗菌能力最好。

圖5是濁度法測量溶液體系中細菌數量，統計學結果(表1)顯示差異具有顯著性(F=110.67,P=0.00)。Ti、pTi和pTi-Da培養體系中菌液的吸光度值最大，分別為1.18±0.16、1.21±0.21和1.30±0.13，兩組間比較差異無統計學意義，證明3種樣品不具有抑制周圍細菌增殖的能力。載銀表面pH4/2、pH7/2、pH10/2、pH4/4、pH7/4、pH10/4、pH4/6、pH7/6、pH10/6的光密度分別為0.37±0.01、0.39±0.03、0.07±0.00、0.36±0.04、0.29±1:Ti; 2:pTi; 3:pTi-Da; 4:pH4/2; 5:pH7/2; 6:pH10/2; 7:pH4/4; 8:pH7/4; 9:pH10/4; 10:pH4/6; 11:pH7/6; 12:pH10/6；與Ti、pTi、pTi-Da比較：*P<0.05；與pH10/2比較：#P<0.05; 與pH10/4比較：△P<0.05; 與pH10/6比較：▽P<0.05

0.11、0.06±0.00、0.44±0.08、0.34±0.05、0.06±0.00，結果顯示，與Ti、pTi和pTi-Da培養體系相比，載銀表面均抑制了體系中細菌的增殖，且差異具有統計學意義(P<0.05)。在所有載銀表面中，pH4和pH7的6組樣品間差異無統計學意義，pH10的3組樣品間差異無統計學意義，pH10的3組樣品對細菌的抑制能力強于pH4和pH7的6組樣品，且差異具有統計學意義(P<0.05)。該結果證明載銀表面均具有良好的抑制周圍細菌增殖的能力，其中以堿性條件下制備表面抑菌能力最強。

圖5 各樣品的細菌增殖結果

圖6 各樣品抑菌環實驗結果

黑色虛線代表抑菌圈；左下方黑色數字代表抑菌環大小；A:Ti; B:pTi; C:pTi-Da; D:pH4/2; E:pH7/2; F:pH10/2; G:pH4/4; H:pH7/4; I:pH10/4；J:pH4/6; K:pH7/6; L:pH10/6

抑菌圈試驗評價了樣品對周圍細菌生長的抑制能力。如圖6所示，未載銀的表面(Ti、pTi、pTi-Da)周圍沒有出現抑菌圈，載銀樣品周圍都出現了大小不等的抑菌圈(黑圈所示)，圖片左下角的黑色數字為抑菌圈的數值，數值越大，說明抑菌效果越好。相同硝酸銀濃度下，隨著pH升高，抑菌圈逐漸增大；相同pH下，隨著硝酸銀濃度增加，抑菌圈逐漸增大。

3 討論

研究通過熱堿處理形成微納米多孔表面，并顯著改善表面的親水性，這2種改變都可以改善種植體的骨整合能力[1]。熱堿處理的另一個優勢是可以在鈦片表面形成大量的羥基，這有利于多巴胺的沉積。多巴胺涂層包含許多官能團(酚羥基、醌基、氨基和亞胺)，酚羥基和醌基可以螯合Ag+并能將Ag+還原為納米單質銀，這種方法相較于其它納米銀制備方法，具有操作簡便、環保等優點。

目前多巴胺介導的載銀表面構建均采用堿性環境，且對于構建載銀表面過程的關鍵調控因素的系統研究很少；另外，AgNPs雖然具有廣譜抗菌能力、不易產生耐藥性[8]等優勢，但其可能對生物系統產生的負面影響(如細胞毒性)不容忽視[9]，所以探究制備載納米銀表面的關鍵影響因素、篩選低載銀量且具有良好抗菌能力的表面制備方法非常重要[10]。考慮到納米銀制備過程中的主要變量為硝酸銀濃度和溶液pH，本實驗對酸性、中性、堿性3種pH的硝酸銀溶液制備表面評價，結果顯示堿性環境還原的納米銀數量大、尺寸小、分布均勻。Fernando et al[11]研究表明，在酸性和中性條件下，納米銀不穩定，容易聚集形成大尺寸的顆粒；在堿性條件下，納米銀表面大量的羥基導致其不易聚集，均勻分布且顆粒尺寸小。Csapó et al[12]也研究了pH對檸檬酸修飾的銀納米的影響，結果同樣顯示pH>7時，納米銀穩定且不易聚集。

本研究進一步評價各制備表面的抗菌能力，原位活/死熒光染色法、稀釋涂布平板法、濁度法和抑菌圈試驗均表明，隨著溶液pH值升高，制備樣品不但表面的抑菌和殺菌能力增強、且對周圍環境中細菌的抑制能力也增強，堿性環境制備表面的抗菌能力最好，推測其與表面載銀量密切相關；另外，硝酸銀濃度對制備表面抗菌性能也有影響，隨著濃度增加，抗菌能力增強，但增強幅度遠小于pH的影響，只有在較敏感的抗菌評價方法中表現明顯(如活死細菌染色和抑菌圈)，推測活死細菌評價與表面納米銀的量直接相關，抑菌圈評價中由于加入細菌數量很少導致微小的銀釋放即可達到抑菌的目的，故這兩個方法可以證明濃度的影響；而涂板法和濁度法反映了溶液體系中的細菌增殖量，這與材料表面銀釋放量和釋放速度、溶液體系大小、溶液中初始細菌數量都有關系，所以導致結果無法與制備體系中銀濃度產生明確的關系。制備溶液中硝酸銀濃度和pH值都可以影響多巴胺表面納米銀的沉積，相較于硝酸銀濃度，溶液pH值對表面制備影響更大，堿性環境更利于納米銀沉積，且制備表面的抗菌性能更好。

另外，表面改性的種植體具有適當骨整合作用，實驗表明，含適量銀的生物材料與哺乳動物細胞(包括成骨細胞)相容[13]。然而，有研究表明，多巴胺原位還原納米銀的表面具有明顯的細胞毒性，可歸因于銀的快速浸出和在培養基中的積累[14]，如Zhang et al[1]觀察到多巴胺載納米銀涂層對成骨細胞黏附和增殖有抑制作用，但為了模擬體內環境，將樣品浸泡于模擬體液7d后，表面形成礦化層，不但促進了細胞的黏附和增殖，且促進了堿性磷酸酶的表達，推測其植入體內會隨著植入時間延長而表現出良好的促成骨效果，本研究所使用的硝酸銀濃度遠低于該研究使用濃度，故推測其可能具有更好的效果。

本研究系統評價了硝酸銀溶液濃度和pH值對制備載納米銀表面的影響，證明兩者對制備表面的抗菌能力有影響，且pH值影響更大，對多巴胺修飾生物材料表面載銀涂層構建具有指導意義，即可以根據使用部位感染發生概率而調控制備參數，獲得合適的表面抗菌性能并減少銀離子的浪費，進而減少環境污染。