過表達NDRG1通過調控VEGF/sFlt-1軸增強缺氧條件下滋養細胞的促血管形成能力

何宜靜，歐 瓊，李 婷，劉 玨

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種妊娠期特發性疾病，也是導致孕產婦及圍產兒病死率攀升的主要原因之一[1]。研究[2]證實，妊娠中晚期胎盤組織缺氧是PE的重要病理特征。N-myc下游調節基因1(N-myc downstream-regulated gene 1，NDRG1)是一種進化上相對保守的應激反應蛋白，可參與細胞增殖、分化、腫瘤侵襲轉移、新血管形成以及各種應激反應[3]。有研究[4]顯示，缺氧可誘導滋養細胞中NDRG1高表達，同時PE患者胎盤組織中NDRG1也呈現高表達[5]，但具體功能和作用機制不詳。但有報道稱[6]，PE患者血清和胎盤組織中可溶性血管內皮生長因子受體1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1)含量升高，而血管內皮細胞生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)含量降低，表明PE患者胎盤血管發育異常，推測NDRG1可能通過調節滋養細胞促血管形成能力參與PE病理缺氧損傷的應答調控。因此，現擬探討NDRG1過表達對缺氧條件下滋養細胞的促血管形成能力的影響，以明確NDRG1在PE發病的作用，為PE的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)、人胎盤滋養層細胞系HTR-8/SVneo(美國ATCC公司)；RPMI-1640培養基(美國Thermo Fisher Scientific公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美國HyClone公司)；NDRG1過表達(pCMV6-AC-NDRG1-GFP)及空載(pCMV6-AC-vector-GFP)慢病毒(2.0×108TU/ml)(上海HANBIO公司)；人源VEGF ELISA檢測試劑盒、人源sFlt-1 ELISA 檢測試劑盒均購自上海卡努生物科技有限公司；Transwell chamber(美國Corning公司)；Matrigel基質膠(美國BD公司)；一步法qRT-PCR試劑盒(北京全式金)；兔抗人NDRG1多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)單克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體(美國CST公司)；辣根過氧化物標記的山羊抗小鼠或兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及感染 采用含5% FBS的RPMI-1640培養基培養HTR-8/SVneo細胞，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養、傳代。取對數期HTR-8/SVneo細胞，調整細胞密度并接種于6孔板(1×105個/孔)，培養至60%融合度時，分別取NDRG1過表達病毒(pCMV6-NDRG1)和陰性對照病毒(Vector)按照病毒感染比率值50 ∶1感染HTR-8/SVneo細胞，另選不做任何處理的HTR-8/SVneo細胞作為空白對照組，分別記為pCMV6-NDRG1組、Vector組和blank組。感染6～8 h后更換新鮮培養液繼續培養，72 h后用嘌呤霉素篩選穩定表達株。

1.2.2缺氧處理及分組 缺氧處理條件參考楊曉濤 等[7]等探索的最佳模擬PE體外細胞模型條件即1% O2培養24 h。根據實驗需要分為4組：① 空白對照組(blank)：采用常氧條件(21% O2+5% CO2+74% N2)培養HTR-8/SVneo細胞24 h；② 缺氧組(Hpx)：采用缺氧條件(1% O2+5% CO2+94% N2)培養HTR-8/SVneo細胞24 h；③Hpx+Vector組：采用缺氧條件培養感染陰性對照病毒的HTR-8/SVneo細胞24 h；④Hpx+pCMV6-NDRG1組：采用缺氧條件培養感染NDRG1過表達病毒的HTR-8/ SVneo細胞24 h。

1.2.3qRT-PCR檢測細胞中各基因mRNA表達水平 分組處理后收集各組細胞，采用TRIzol法提取總RNA并測定濃度。取2 μg總RNA采用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板、GAPDH為內參進行qRT-PCR擴增。引物序列：NDRG1 Forward：5′-CCAACCTCCCACCCCTGATACA-3′，Reverse：5′-CCACCCCGACAAGAGCAAAGAG-3′；sFlt-1 Forward：5′-ACAATCAGAGGTGAGCACTGCAA-3′，Reverse：5′-TCCGAGCCTGAAAGTTAGCAA-3′；VEGF Forward：5′-TGCAGATTATGCGGATCAAACC-3′，Reverse：5′-TGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAG-3′；GAPDH Forward：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，Reverse：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。qRT-PCR反應程序為95 ℃預變性60 s、95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環。采用2-△△Ct法計算NDRG1、sFlt-1和VEGF等mRNA相對表達量。

1.2.4ELISA法檢測細胞培養上清中VEGF及sFlt-1蛋白表達 收集各組細胞培養上清液，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度(optical density，OD)值，根據標準曲線計算細胞培養上清液中VEGF和sFlt-1蛋白分泌量。

1.2.5Western blot檢測細胞中相關蛋白表達 收集各組細胞沉淀，加入適量RIPA裂解液，冰上充分裂解30 min，4 ℃條件下12 000 r/min 離心20 min，收集上清液，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取25 μg蛋白采用沸水浴變性后上樣，通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，分別加入NDRG1抗體(1 ∶1 000)、MMP-2抗體(1 ∶1 000)、MMP-9抗體(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，加入二抗(1 ∶10 000)室溫孵育30 min，加入超敏ECL化學發光底物，在全自動凝膠成像系統中曝光顯影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算各孔條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值比值表示相對蛋白表達量。

1.2.6小管形成實驗檢測細胞體外促血管形成能力 取各組細胞，缺氧處理24 h后分別收集各組細胞上清液，1 500 r/min離心5 min，除去雜質及死細胞，收集上清液備用。冰上溶解Matrigel基質膠，鋪于96孔板中并置于培養箱中凝膠30 min。用上述各組上清液分別重懸HUVEC細胞，調整細胞濃度為2×105個/ml，向鋪好基質膠的96孔板中每孔加入150 μl細胞懸液，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養18 h，顯微鏡下觀察細胞成管情況并拍照，并隨機取5個視野統計小管形成數量取均值。

1.2.7Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 平鋪Matrigel基質膠于Transwell上室制成凝膠。取對數生長期的各組細胞，使用無血清培養基重懸細胞并調整細胞濃度至1×105個/ml，上室接種200 μl細胞懸液，下室加入500 μl含有20% FBS的RPMI-1640培養液，缺氧處理24 h后經4%多聚甲醛固定、0.1%結晶紫室溫染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照，選取5個隨機視野，統計視野中細胞數目，取平均值為侵襲的細胞數量。

2 結果

2.1 缺氧誘導HTR-8/SVneo細胞中NDRG1表達qRT-PCR實驗結果顯示，與blank組比較，Hpx組細胞中NDRG1 mRNA表達水平升高(t=9.736，P<0.05)；與Hpx組與Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細胞中NDRG1 mRNA表達水平也升高(F=391.323，P<0.001)。見圖1A。Western blot結果顯示，與blank組比較，Hpx組細胞中NDRG1 蛋白表達水平升高(t=10.183，P<0.05)；與Hpx組與Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細胞中NDRG1 蛋白表達水平也升高(F=76.333，P<0.05)。見圖1B。

圖1 各組細胞中NDRG1 mRNA和蛋白表達水平

A: qRT-PCR檢測各組細胞中NDRG1 mRNA表達水平；B：Western blot檢測各組細胞中NDRG1蛋白表達水平；a：blank組；b：Hpx組；c：Hpx+Vector組；d：Hpx+pCMV6-NDRG1組；與blank組比較：*P<0.05；與Hpx組或Hpx+Vector組比較：#P<0.05，###P<0.001

2.2 過表達NDRG1對缺氧條件下HTR-8/SVneo細胞中VEGF和sFlt-1表達的影響qRT-PCR實驗結果顯示，與blank組比較，缺氧處理后Hpx組細胞中VEGF和sFlt-1 mRNA水平均增加(t=39.792、33.130，P<0.05)；與Hpx組與Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細胞中VEGF mRNA水平再次增加(F=967.729，P<0.001)，而sFlt-1 mRNA水平則降低(F=143.156，P<0.001)。見圖2A。ELISA檢測結果顯示，與blank組比較，缺氧處理后Hpx組細胞分泌的VEGF和sFlt-1蛋白水平升高(t=16.572、33.322，P<0.05)；與Hpx組與Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細胞分泌的VEGF蛋白水平再次升高(F=290.098，P<0.001)，而分泌的sFlt-1 蛋白水平則降低(F=270.398，P<0.001)。見圖2B。

圖2 NDRG1過表達對缺氧后各組細胞VEGF和sFlt-1表達的影響

A: qRT-PCR檢測各組細胞中VEGF和sFlt-1 mRNA表達水平；B：ELISA檢測各組細胞培養上清中VEGF和sFlt-1蛋白的表達水平；a：blank組；b：Hpx組；c：Hpx+Vector組；d：Hpx+ pCMV6-NDRG1組；與blank組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與Hpx組或Hpx+Vector組比較：###P<0.001

2.3 過表達NDRG1增強缺氧條件下HTR-8/SVneo細胞的促血管形成能力小管形成實驗結果顯示，blank組、Hpx組、Hpx+Vector組和Hpx+pCMV6-NDRG1組HUVEC細胞血管成管數量依次為(21.67±3.24)、(6.67±2.08)、(6.33±2.08)和(69.67±6.02)個，與blank組比較，缺氧處理后Hpx組細胞培養上清液誘導的HUVEC細胞血管成管數量降低(t=6.784，P<0.05)；與Hpx組和Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細胞培養上清誘導HUVEC細胞血管成管數量增加(F=266.007，P<0.001)。見圖3。

圖3 NDRG1過表達對缺氧條件下HTR-8/SVneo細胞促血管形成能力的影響 ×100

A：blank組；b：Hpx組；c：Hpx+Vector組；d：Hpx+pCMV6-NDRG1組；與blank組比較：*P<0.05；與Hpx組或Hpx+Vector組比較：###P<0.001

2.4 過表達NDRG1促進缺氧條件下HTR-8/SVneo細胞的侵襲Transwell實驗結果顯示，blank組、Hpx組、Hpx+Vector組和Hpx+pCMV6-NDRG1組侵襲細胞數量依次為(154.34±8.50)、(55.69±9.61)、(57.67±6.11)和(447.33±22.01)個，與blank組比較，Hpx組侵襲細胞數目減少(t=13.183，P<0.05)；與Hpx組和Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組侵襲細胞數目增加(F=743.799，P<0.001)。見圖4。Western blot實驗顯示，與blank組比較，Hpx組細胞中MMP-2和MMP-9蛋白均顯著下調(t=23.799、21.257，P<0.01)；與Hpx組和Hpx+Vector組比較，Hpx+pCMV6-NDRG1組細胞中MMP-2和MMP-9蛋白均顯著上調(F=314.440、197.271，P<0.001)。見圖5。

圖4 過表達NDRG1對缺氧條件下HTR-8/SVneo細胞侵襲的影響 ×200

A：blank組；b：Hpx組；c：Hpx+Vector組；d：Hpx+pCMV6-NDRG1組；與blank組比較：*P<0.05；與Hpx組或Hpx+Vector組比較：###P<0.001

3 討論

妊娠早期，滋養層細胞還沒完成對母體血管的侵入，胎盤的發育處于一個生理缺氧狀態，而這種局部缺氧可促進滋養層細胞生長、分化、浸潤及血管形成[8]。然而，待胎盤供血系統完全形成后滋養細胞持續缺氧將會導致多種妊娠并發癥，例如妊娠期高血壓疾病。長期以來胎盤缺氧被認為是導致PE的關鍵因素，持續長時間缺氧可導致滋養層細胞浸潤能力下降[9]，而滋養層細胞浸潤能力下降導致子宮螺旋動脈重塑障礙可誘發胎盤組織缺血缺氧，形成惡性循壞。此外，胎盤血管生成異常也是PE的重要病理特征，有研究[10]顯示，PE孕婦子宮螺旋動脈血管阻力大小與胎盤血管新生呈正相關性。因此，通過增強胎盤血管形成能力或許能夠改善PE。本研究結果顯示，NDRG1過表達可以增強缺氧條件下HTR-8/ SVneo促血管形成能力，提示NDRG1可能作為預防和治療PE的關鍵靶點。

圖5 過表達NDRG1對缺氧條件下HTR-8/SVneo細胞MMP-2和MMP-9蛋白的影響

A：blank組；b：Hpx組；c：Hpx+Vector組；d：Hpx+pCMV6-NDRG1組；與blank組比較：**P<0.01；與Hpx組或Hpx+Vector組比較：###P<0.001

NDRG1可表達于多種細胞，包括滋養層細胞，其功能復雜，且具有組織特異性。多項研究表明，NDRG1是一種應激反應蛋白，起到應激損傷修復的作用，在胎盤發育及胎盤滋養細胞應答應激反應中起重要調節作用。例如，Larkin et al[11]研究顯示，NDRG1缺失不利于胎兒生長，并且會降低子宮對缺氧損傷的應答能力。Chen et al[12]報道稱，缺氧能夠誘導NDRG1表達，沉默NDRG1表達能促進缺氧應激誘導的滋養層細胞凋亡。本研究結果也證實，缺氧處理能夠誘導HTR-8/SVneo細胞中NDRG1蛋白的表達。提示NDRG1在PE病理過程中可能扮演重要角色。

VEGF是重要的促血管生成因子，而其拮抗性受體sFlt-1則是主要的抗血管生成因子，二者的動態平衡共同維持正常的血管形成過程。有研究[13]顯示，VEGF/ sFlt-1動態失衡引起的血管功能障礙是導致PE發生的病理基礎。本研究結果顯示，缺氧處理24 h后HTR-8/SVneo細胞中VEGF和sFlt-1表達量均顯著升高，同時細胞的促血管形成能力和侵襲能力顯著降低。周瓊 等[14]研究也顯示，CoCl2誘導的缺氧環境可以刺激滋養細胞TEV-1持續表達和分泌sFlt-1，而VEGF表達則隨缺氧時間的延長呈現出先上升后下降的趨勢，48 h達到峰值，與本研究結果相吻合。此外，缺氧處理后HTR-8/SVneo細胞中VEGF與sFlt-1表達量均顯著增加，而細胞的促血管形成能力及侵襲能力則顯著降低，可能是由于缺氧刺激條件下HTR-8/SVneo細胞中sFlt-1表達量急劇增加，導致sFlt-1瞬時表達量大于VEGF，打破了VEGF/ sFlt-1動態平衡，進而表現出抗血管形成的作用。

為了進一步探究NDRG1在滋養層細胞缺氧應激反應中發揮的作用，本研究通過感染NDRG1過表達慢病毒，建立NDRG1過表達的HTR-8/SVneo細胞系，再進行缺氧處理。結果顯示，NDRG1過表達可顯著降低缺氧條件下HTR-8/SVneo細胞中sFlt-1表達量，提高VEGF表達量，并提高HTR-8/SVneo細胞的促血管形成和侵襲能力。說明NDRG1過表達能夠促進缺氧條件下HTR-8/SVneo細胞的促血管形成和侵襲能力。有研究[15]顯示，缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible transcription factor-1α，HIF-1α)能夠靶向結合NDRG1啟動子，調控NDRG1的轉錄，而HIF-1α是缺氧應激反應中的中樞調控因子，故缺氧可誘導NDRG1表達。此外，VEGF是HIF-1α下游的靶基因，因此NDRG1高表達可能通過介導VEGF表達，協調VEGF/ sFlt-1動態平衡，發揮促血管形成的作用。

綜上所述，NDRG1過表達可以促進缺氧條件下人滋養層細胞HTR-8/SVneo的促血管形成能力，其機制可能與介導VEGF/ sFlt-1動態平衡有關，進而在胎盤血管生成中起重要調節作用。因此，NDRG1有可能成為預防和治療PE的關鍵靶點。