Mdivi-1對匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元保護作用及其機制研究

甘 露，周弟彌，張 磊，陳 琳

癲癇是由多種原因引發的慢性腦部疾病，全球大約有5千萬人患病，其中我國患病人數超過9百萬，患病率約為5% ～ 7%[1]。長期、反復的癲癇發作會給患者與社會帶來沉重的負擔。近年來，盡管癲癇研究的許多方面已取得了很大進展，但發病機制并未得到徹底解決。故進一步研究癲癇的發病機制并尋找有效的防治措施是目前急需解決的問題。

線粒體分裂蛋白抑制劑(mitochondrial division inhibitor，Mdivi-1)是線粒體動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)的選擇性抑制劑，屬于喹唑啉酮衍生物，可通過抑制GTP酶活性發揮作用[2]。文獻[3-4]報道Mdivi-1可對膿毒癥大鼠器官功能起保護作用，但在癲癇模型中Mdivi-1相關研究報道較少?，F通過建立癲癇大鼠模型，觀察各組大鼠行為學及Mdivi-1對海馬神經元的保護作用，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物20只雄性SD大鼠(清潔級，6～8周齡)，體質量200～250 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證：SCXK(湘)2015-005]，實驗前適應性飼養1周，室溫(22±2)℃，恒溫、純凈飲水及標準飼料分籠飼養。所有的實驗過程均經動物倫理委員會同意，實驗過程符合3R原則。

1.2 試劑與儀器氯化鋰、匹魯卡品(美國sigma公司)；Mdivi-1抑制劑(美國selleck公司)；兔抗 DRP1、ENT1抗體(美國 Abcom 公司)；BCA 蛋白試劑液(上海碧云天)；透射電鏡(日立 HITACHI 公司)；激光共聚顯微鏡(德國 Leica 公司)；全自動曝光儀(美國 BioRad 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1分組與模型建立 將大鼠隨機分為正常組、模型組、DMSO組、Mdivi-1組，保證造模成功后每組均有5只大鼠入組。癲癇造模參考文獻[5]方法：氯化鋰-匹魯卡品模型。正常組：腹腔注射同等容量的生理鹽水替代模型組中匹魯卡品、氯化鋰溶液；模型組：腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg，0.9% NaCl配制)用于增強匹魯卡品敏感性，20 h后腹腔注射匹魯卡品(30 mg/kg，0.9% NaCl配制)，在注射匹魯卡品前30 min注射1 mg/kg硫酸阿托品，拮抗外周膽堿能反應，直至出現 Racine分級標準[6]中的Ⅳ-V級癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)；Mdivi-1組和DMSO組：在注射匹魯卡品前30 min分別腹腔注射Mdivi-1抑制劑(1.2 mg/kg)或0.1%二甲基亞砜(DMSO)溶液，其余步驟同模型組。癲癇大鼠成功建模后，各組大鼠于24 h腹腔麻醉，取大腦海馬組織，放入-80 ℃冰箱保存。

1.3.2大鼠行為學觀察 達到Racine分級標準[6]中的Ⅳ-V級SE為癲癇模型制作成功。分別記錄各組大鼠致癇成功率及潛伏期。

1.3.3透射電鏡 取海馬CA1組織，置于4% 戊二醛溶液中固定過夜，磷酸緩沖液沖洗后用1%鋨酸固定1 h，按照脫水、浸透、包埋、切超薄、染色的順序，每個電鏡標本取10個視野觀察，進行拍片后統計。

1.3.4免疫組化檢測各組大鼠海馬區DRP1表達 大鼠海馬組織石蠟包埋后切成4 μm薄片，脫蠟、水化，PBS洗滌5 min×3次，3% H2O2孵育10 min，PBS洗滌5 min×3次。高壓修復，山羊血清封閉，加入DRP1抗體(1 ∶500)，4 ℃過夜，PBS 沖洗3次，辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(1 ∶300)孵育，漂洗，DAB顯色，蘇木精復染，分化、脫水、干燥、中性樹脂封片。

1.3.5免疫熒光染色檢測各組大鼠海馬區DRP1表達 將海馬組織冰凍切片，用4%多聚甲醛固定，用PBS(0.01 mol/L) 漂洗3次，每次10 min，微波修復，PBS清洗，加山羊血清封閉液1 h，棄去，滴加DRP1抗體(1 ∶50)，4 ℃ 孵育過夜，37 ℃復溫1 h，PBS溶液清洗，加Cy3標記山羊抗小鼠熒光二抗(1 ∶100)37 ℃避光孵育2 h，PBS清洗，滴加抗熒光淬滅封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6Western blot檢測各組大鼠海馬區DRP1、平衡型核苷轉運載體1(equilibrative nucleoside transporter -1，ENT1)變化 將冰凍的海馬組織取出，加入RIPA裂解液，離心，取上清液采用 BCA 法測定蛋白濃度，于-80 ℃冰箱中保存備用。每孔加20 μl蛋白樣本，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，電泳結束后將蛋白條帶轉印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入一抗DRP1(1 ∶1 000)、ENT1(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后，加二抗室溫孵育1 h，ECL顯影。用ImageJ 圖像分析軟件分析吸光度值(A)，蛋白相對表達水平=A目的蛋白/Aβ-actin。

2 結果

2.1 Mdivi-1對大鼠行為活動的影響與模型組或DMSO組相比，Mdivi-1組大鼠癲癇發作潛伏期增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組或DMSO組相比，大鼠癲癇發作頻率下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 Mdivi-1對癲癇大鼠發作潛伏期及次數影響

A：癲癇發作潛伏期；B：癲癇發作次數；與模型組或DMSO組比較：*P<0.05

2.2 電鏡觀察癲癇大鼠海馬區結構變化正常組大鼠海馬CA1區結構完好，線粒體未發現損傷；癲癇組部分內外膜崩解，線粒體明顯破壞、腫脹；Mdivi-1組線粒體基質密度下降、部分嵴分裂，腫脹程度下降。見圖2。

圖2 電鏡觀察大鼠海馬區超微結構變化 ×30 000

2.3 免疫組化檢測癲癇大鼠海馬區DRP1表達DRP1陽性細胞主要位于神經細胞膜上。與正常組相比，模型組大鼠腦組織海馬CA1、CA3、DG區DRP1陽性細胞數增多，而Mdivi-1組陽性細胞數少于模型組(P<0.05)。見圖3。

圖3 免疫組化檢測癲癇大鼠海馬區DRP1表達 ×200與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖4 免疫熒光檢測癲癇大鼠海馬區DRP1表達 ×400

2.4 免疫熒光檢測癲癇大鼠海馬區DRP1表達DRP1與星形膠質細胞特異性標志物(glial fibrillary acidic protein，GFAP)不共表達，而與神經元樹突特異性標志物(microtubule-associated protein 2，MAP2)共表達。見圖4。

2.5 Western blot檢測癲癇大鼠海馬區DRP1及ENT1表達與正常組相比，DMSO和模型組中ENT1、DRP1蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。而與模型組相比，Mdivi-1組中ENT1、DRP1蛋白表達下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5、6。

圖5 ENT1蛋白相對表達

與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖6 DRP1蛋白相對表達

與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

癲癇是由已知或未知原因引起的慢性腦部疾病，為神經內科最常見的疾病之一[6]，其發作會引發海馬區神經細胞凋亡或壞死，引起學習、記憶和認知損害。癲癇表型中線粒體功能障礙及染色體長序列基因突變可能是病因。線粒體是細胞內氧化磷酸化形成ATP的主要場所，對活性氧的產生與調節、神經元凋亡、鈣穩態、神經遞質的合成以及氧化還原反應起關鍵作用。

Mdivi-1是DRP1的選擇性抑制劑，可以抑制酵母的Dnm1及GTP 酶活性，調節 DRP1功能，從而抑制線粒體的過度分裂[7]。本研究結果表明，與模型組或DMSO組相比，Mdivi-1組大鼠癲癇發作潛伏期延長，而癲癇發作頻率下降(P<0.05)。說明 Mdivi-1可能下調 DRP1表達，減輕癲癇的發作。電鏡觀察結果顯示，正常組大鼠海馬CA1區結構完好，線粒體未發現損傷。癲癇大鼠海馬區線粒體內外膜崩解，線粒體明顯破壞、腫脹，而Mdivi-1組線粒體基質密度下降，腫脹程度下降，這與文獻[8]報道基本相符，提示線粒體可能參與了癲癇的形成。

線粒體是一種高度動態變化的細胞器，頻繁出現分裂和融合，其分裂融合的過程稱線粒體動力學。正常狀態下，線粒體的分裂融合處于動態平衡以維持線粒體的生物學功能，但在多種因素下，如氧化應激、缺血再灌注等，都會打破該平衡，使其分裂融合發生紊亂，這在許多神經系統變性疾病中已被證實[9]。線粒體的分裂、融合是在多種蛋白分子精細調控下發生的，其中線粒體分裂由動力蛋白家族成員DRP1和線粒體分裂蛋白1所介導。DRP1活性與翻譯后修飾有關，它參與細胞許多生物反應過程，如細胞凋亡及能量代謝等[10]。本研究中Western blot檢測結果顯示，DMSO和模型組中DRP1蛋白表達高于正常組，而與模型組相比，Mdivi-1組DRP1蛋白表達下降(P<0.05)；免疫組化檢測結果表明，DRP1 主要在細胞膜上表達，模型組大鼠腦組織海馬CA1、CA3、DG區DRP1陽性細胞數增多，而Mdivi-1組減少(P<0.05)，同時免疫熒光檢測結果也顯示DRP1在海馬神經元中有表達，這些均提示DRP1可能參與了癲癇的形成。文獻[11]報道，癲癇大鼠被抑制后，海馬區神經元損傷減輕，可能與 DRP1 介導的線粒體動力學有關，本研究結果與之基本一致。

腺苷(adenosine, AD)是大腦活動的重要平衡調節器，它是一種抑制性神經遞質[12]。ENT1可以通過神經元和膠質細胞膜完成調節腦內細胞內外AD濃度的作用[13]。由于細胞內ATP濃度較高，當發生缺氧或代謝激活、受損等情況下，胞內ATP和AD能通過核苷轉運釋放至細胞外，造成局部水平升高，而AD還可以通過細胞分泌形式少量釋放。朱會宇 等[14]報道，星形細胞將囊泡內ATP釋放至胞外后，由核苷酸酶降解產生AD。吳艷芝 等[15]報道，癲癇發作后可引起大鼠腦組織中ATPase活性增強，AD及ATP含量增高。課題組通過免疫組化及Western blot檢測顯示，Mdivi-1組大鼠海馬區ENT1 陽性細胞數及蛋白表達水平較模型組均下降，推測其可能機制為Mdivi-1阻斷DRP1介導的線粒體動力學，從而使 ATP合成發生障礙，這導致細胞外AD水平下降，進而下調 ENT1 表達，但其具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，Mdivi-1能靶向阻斷DRP1，調控線粒體動力學平衡，從而影響 ENT1表達。Mdivi-1有希望成為理想的神經保護劑，為抗癲癇治療提供新的思路和方法。