lncRNA FEZF1-AS1在膠質瘤中的表達水平及其生物學功能

趙玉紅，高 陽，趙洪衛，李 勐，邵 偉

膠質瘤是成人中樞神經系統中最常見的原發性惡性腫瘤，占所有中樞神經系統腫瘤的30%，占所有惡性腦腫瘤的80%[1]。研究[2]報道膠質瘤的發病率為3.19/10萬，2015年新發膠質瘤病例多于10萬，且6萬多膠質瘤患者死亡。盡管采取了多模式積極治療，但由于膠質瘤惡性程度較高，治療過程中易發生疾病進展和復發，膠質瘤患者的生存率仍令人沮喪，5年總生存率不足5%[1-2]，因此探討膠質瘤新的治療方法，改善膠質瘤患者的預后具有重要的研究意義。研究膠質瘤的分子機制有助于治療靶標的發現，而研究[3-4]報道膠質瘤的發病機制涉及遺傳、表觀遺傳和轉錄異常。長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNA,lncRNAs)屬于表觀遺傳學的一種，在腫瘤的發生發展中具有重要的調控作用，其表達的變化對腫瘤的發生和發展至關重要，可以作為腫瘤治療的靶標，并逐漸成為腫瘤研究領域的熱點[5]。LncRNA FEZ家族鋅指1反義RNA 1(lncRNA FEZF1-AS1)位于染色體7q31.32上，長度為2564 bp轉錄本，定位于FEZF1基因的反義鏈上，是最近被鑒定的lncRNA，其失調已在結直腸癌、食管癌和前列腺癌被報道[6-8]，FEZF1-AS1高表達促進腫瘤增殖、侵襲和轉移等惡性生物學行為。越來越多表達異常的LncRNAs在膠質瘤中被發現[5,9]，但是目前并未有FEZF1-AS1在膠質瘤中的相關報道，故該文主要探究FEZF1-AS1是否在膠質瘤中發揮重要功能。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑FEZF1-AS1、內參GAPDH引物購自北京天根生物科技有限公司； TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit逆轉錄和Fast Start Universal SYBR Green Mastermix擴增(qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司；膠質瘤細胞系U87購自上海中國科學院；DMEM培養基、FBS購自美國gibco公司；FEZF1-AS1敲減質粒(FEZF1-AS1 shRNA)和TOP / FOP質粒購自上海吉瑪基因公司；MTS試劑購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Coring公司；Boyden基質膠購自美國BD公司；β-catenin抗體(ab32572)購自英國abcam公司。

1.2 病例資料選取2013年1月～2014年6月入住濱州醫學院附屬醫院行手術治療的膠質瘤患者，患者具有完整的病例資料和隨訪資料，術前未接受過抗腫瘤治療，經病理確診為膠質瘤組織標本共計60例，取同一時期入住濱州醫學院附屬醫院神經外科獲得的正常腦組織40例作為對照組。所有患者均簽署知情同意書，操作符合濱州醫學院附屬醫院倫理委員會標準。

1.3 qRT-PCR采用TRIzol試劑分離組織和細胞中的總RNA，將總RNA進行逆轉錄，以cDNA作為模板，按照Fast Start Universal SYBR Green Mastermix試劑盒說明書進行擴增。分析各樣品的循環閾值(threshold cvcle，Ct)，用2-ΔΔCt法計算FEZF1-AS1的相對表達量。FEZF1-AS1引物 F:5′-TTAGGAGGCTTGTTCTGTGT-3′,R:5′-GCGCAGGTACTTAAGA-AAGA-3′；GAPDH引物 F:5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCT-3′,R:5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

1.4 細胞培養及shRNA轉染U87用含有10% FBS的DMEM培養基培養，放置在37 ℃、5% CO2全濕培養箱中。將呈對數生長的U87細胞消化，以2×105個/孔鋪至6孔板中，分為sh-NC和sh-FEZF1-AS1兩組，鋪板12 h按說明書將對照shRNA和FEZF1-AS1 shRNA與脂質體2 000混勻后轉染至各組U87細胞中進行轉染，培養箱中培養用于后續研究。

1.5 MTS測細胞增殖能力U87細胞消化，以2 000個/孔細胞鋪至96孔板中，分為sh-NC和sh-FEZF1-AS1，每組設置6個復孔，并按上述shRNA轉染方法進行轉染。在細胞轉染的0、24、48和72 h時，加入MTS試劑，繼續在37 ℃培養箱中培養2 h，酶標儀檢測樣品在波長490nm處的吸光度(optical density,OD)值。

1.6 Boyden實驗檢測細胞侵襲能力收集轉染48 h后細胞，無血清培養基洗3次，以1×105個/孔、100 μl無血清培養基加入Transwell小室中，將小室放入裝有500 μl完全培養基的24孔板中培養。10 h后終止培養，甲醇固定細胞，結晶紫染色，顯微鏡下計數細胞穿膜數。

1.7 TOP/FOP報告基因U87細胞以1×105個/孔鋪至6孔板中，分為sh-NC和sh-FEZF1-AS1，每組設置3個復孔，按上述轉染方法進行FEZF1-AS1 shRNA和TOP/FOP質粒的共轉染。轉染細胞48 h后收集細胞，使用熒光素酶報告分析系統評估熒光素酶活性。

1.8 Western blot檢測β-catenin蛋白的表達收集轉染48 h時的細胞，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，超聲裂解30 min，4℃、14 000 r/min離心20 min。通過10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質，然后轉移至PVDF膜，封閉液室溫孵育1 h，β-catenin一抗稀釋液(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗稀釋液(1 ∶1 000)室溫孵育2 h，ECL化學發光法曝光條帶。

2 結果

2.1 FEZF1-AS1在膠質瘤組織中的表達水平qRT-PCR檢測結果顯示FEZF1-AS1在60例膠質瘤組織中的表達為1.50±0.65，高于40例正常腦組織1.00±0.52(t=4.14,P=0.000)。見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測FEZF1-AS1在膠質瘤組織中的表達高于正常腦組織與正常腦組織比較：*P<0.05

2.2 FEZF1-AS1的表達水平與膠質瘤患者臨床病理參數的關系FEZF1-AS1在膠質瘤組織中的表達水平與患者腫瘤WHO臨床分級相關(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小和部位均無關，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 FEZF1-AS1在膠質瘤組織中的表達水平與臨床病理參數之間的關系

2.3 膠質瘤組織中FEZF1-AS1的表達水平對患者預后的影響對60例膠質瘤患者進行術后隨訪，并按FEZF1-AS1在膠質瘤組織中的表達水平，將≤1.50定義為FEZF1-AS1低表達，>1.50定義為FEZF1-AS1高表達。Kaplan-Meier生存分析結果顯示：FEZF1-AS1高表達膠質瘤患者的5年生存率明顯低于FEZF1-AS1低表達患者(χ2=9.59，P=0.002)。見圖2。

2.4 檢測FEZF1-AS1 shRNA轉染效果FEZF1-AS1 shRNA經脂質體轉染U87細胞48 h后，qRT-PCR結果顯示FEZF1-AS1在sh-NC組細胞中的表達水平為1.00±0.05，sh-FEZF1-AS1組細胞中的表達為0.18±0.04(t=11.28,P=0.000)，表明FEZF1-AS1 shRNA 轉染成功抑制U87細胞中FEZF1-AS1的表達。

2.5 FEZF1-AS1對膠質瘤細胞增殖能力的影響MTS實驗檢測抑制FEZF1-AS1的表達對U87細胞增殖能力的影響，結果顯示與sh-NC組相比，sh-FEZF1-AS1組細胞增殖能力降低。見圖3。

圖3 MTS檢測細胞增殖與sh-NC組比較：*P<0.05

2.6 FEZF1-AS1對膠質瘤細胞侵襲能力的影響Boyden實驗檢測抑制FEZF1-AS1的表達對U87細胞侵襲能力的影響，結果顯示sh-NC組細胞穿膜數為(148.35±13.57)個，sh-FEZF1-AS1組細胞穿膜數為(69.87±9.66)個，與sh-NC組相比，sh-FEZF1-AS1組細胞侵襲能力降低。見圖4。

2.7 FEZF1-AS1對膠質瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路活化的影響TOP / FOP報告基因檢測抑制FEZF1-AS1的表達對U87細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響，結果顯示sh-NC組熒光素酶活性為1.00±0.10，sh-FEZF1-AS1組熒光素酶活性為0.51±0.11，與sh-NC相比，sh-FEZF1-AS1組細胞熒光素酶活性降低，Wnt/β-catenin信號通路被抑制。

圖4 Boyden實驗檢測細胞侵襲 結晶紫染色×100

2.8 FEZF1-AS1對膠質瘤細胞中β-catenin蛋白表達的影響Western blot檢測抑制FEZF1-AS1的表達對β-catenin蛋白表達的影響，結果顯示與sh-NC組相比，sh-FEZF1-AS1組細胞中β-catenin蛋白表達減少。見圖5。

圖5 Western blot檢測細胞中β-catenin蛋白表達

3 討論

膠質瘤作為最常見的原發性惡性腦腫瘤，在男性和女性中均具有高發病率[1]。目前膠質瘤的標準治療包括最大程度的手術切除、化學藥物治療和放療，由于膠質瘤對周圍組織具有高侵襲性，患者在治療過程中產生化療和放療抵抗，使得膠質瘤患者復發率高，而高級別膠質母細胞瘤占膠質瘤的大部分(56.6%)，替莫唑胺被認為是治療膠質母細胞瘤最有效的藥物，雖然可以延長膠質母細胞瘤患者的生存期，但是效果仍然不理想[10]。分子靶向藥物是新興的腫瘤治療手段，在肺癌等常見腫瘤中已經廣泛應用[11]，并取得了顯著療效，目前膠質瘤的治療缺乏有效的分子靶向藥物，因此研究治療膠質瘤的潛在分子靶標，有助于改善患者的預后和生存質量。

lncRNAs是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，通過調控轉錄、轉錄后和表觀遺傳影響基因的表達水平[9]。大量證據表明新近發現的lncRNA FEZF1-AS1可作為致癌基因發揮作用。FEZF1-AS1在結直腸癌組織和細胞系中高度表達，功能實驗[6]發現FEZF1-AS1水平的降低抑制結直腸癌細胞的遷移、侵襲和增殖能力。FEZF1-AS1在食管癌中上調，FEZF1-AS1的沉默抑制食管癌細胞的遷移和侵襲[7]。FEZF1-AS1在膠質瘤中的表達水平未知，本實驗中qRT-PCR檢測顯示FEZF1-AS1在膠質瘤組織中的表達高于在正常腦組織中的表達。證據顯示腫瘤患者相關因素如年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤分級等與患者存活有關聯[12]，故本文對FEZF1-AS1的表達水平與患者病理參數之間的關系進行了分析，結果顯示FEZF1-AS1的表達水平越高，患者腫瘤WHO級別越高，與Zhang et al[13]報道FEZF1-AS1表達增加與患者淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤分化差、腫瘤浸潤深度高和臨床分期晚期不良病理參數相關的結果一致，同時Zhang et al[13]發現FEZF1-AS1的高表達與腫瘤患者的總生存期和無病生存期較短相關。課題組對60例膠質瘤患者的5年生存率進行分析，結果顯示高表達FEZF1-AS1的膠質瘤患者5年生存率較低。

FEZF1-AS1在膠質瘤中的表達具有重要的臨床意義，具體的生物學功能需要在細胞水平進行研究。采用敲減質粒轉染膠質瘤細胞U87，功能實驗[5]顯示FEZF1-AS1表達降低后抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力。在前列腺癌中通過Notch信號傳導途徑失活抑制FEZF1-AS1的表達，降低細胞增殖、侵襲和遷移能力，并誘導細胞晚期凋亡的發生[8]；Yang et al[7]報道FEZF1-AS1在食管癌中表達增加，并與β-catenin的表達水平呈正相關，沉默FEZF1-AS1可降低β-catenin的mRNA和蛋白水平，可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路發揮作用。Wnt/β-catenin是調控腫瘤惡性生物學行為的關鍵通路之一，在各種腫瘤中異常活化促進腫瘤的惡性增殖和侵襲轉移[14]。在膠質瘤中Wnt/β-catenin可作為藥物治療的潛在靶點[15]，在膠質瘤中高表達的FEZF1-AS1是否通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進腫瘤的增殖和侵襲。采用TOP / FOP報告基因檢測FEZF1-AS1對Wnt/β-catenin信號通路活性的影響，結果顯示sh-FEZF1-AS1組熒光素酶活性降低，而Western blot結果顯示sh-FEZF1-AS1組細胞中β-catenin蛋白的表達降低，表明敲減FEZF1-AS1的表達會通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活性降低膠質瘤細胞增殖和侵襲的能力。

綜上所述，FEZF1-AS1在膠質瘤中高表達，并與膠質瘤患者的不良預后相關。FEZF1-AS1可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進膠質瘤增殖和侵襲。FEZF1-AS1是膠質瘤促癌因子，可能是治療膠質瘤的潛在藥物靶點。