肝細胞癌中膜鐵轉運蛋白的表達及意義

王珊珊，汪 靜，張 浩，王 琴，楊 凱，管世鶴

肝癌是全球病死率最高的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關死亡的第二大原因[1]，特別是在發展中國家。在我國每年有近38萬人死于肝癌，面對如此嚴峻的形勢，肝癌的治療備受關注。鐵是人體必不可少的微量元素之一，在人體中參與腺嘌呤核苷三磷酸 (adenosine triphosphate，ATP)的合成，氧的運輸及DNA合成等多種代謝過程，而膜鐵轉運蛋白(ferroportin，FPN)作為唯一已知的鐵離子輸出蛋白，在體內廣泛分布，是參與機體鐵代謝的重要調節因子。已有研究[2- 3]表明，鐵代謝紊亂引起的過量鐵離子與腫瘤的發生，轉移及預后有關。該研究擬通過分析FPN在肝細胞癌中表達及與患者的分期和預后的關系，闡明FPN可能在肝細胞癌的發生發展起到的作用，為肝細胞癌的免疫治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2017年3月～2019年3月安徽醫科大學第二附屬醫院檢驗科血清169例。肝癌組80例，慢性肝病組48例，健康對照組血清41例。肝癌組男58例，女22例，年齡在28～86(52.61±13.61)歲；慢性肝病組男38例，女10例，年齡在27～75(47.40±11.17)歲；健康對照組男25例，女16例，年齡在16～80(48.98±14.30)歲。 收集2017年3月～2018年8月安徽醫科大學第四附屬醫院病理科石蠟包埋的肝組織46例、肝癌組織32例、正常肝良性病變肝組織14例。肝癌組織男28例，女4例，年齡在39～70 (56.87±13.39) 歲。肝良性病變肝組織男6例，女8例，年齡在55～69(62.71±5.99)歲。所有受檢人員性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義，且均未服用華法林抗凝劑、維生素K及維生素K拮抗劑等藥物。

1.2 納入標準和排除標準納入標準： ① 所有肝癌患者均符合《原發性肝癌診療規范(2017版)》診斷標準；② 所有慢乙肝患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》診斷標準；③ 血清標本的選擇均為受檢者入院后第1次檢測。排除標準：① 排除其他惡性腫瘤；② 排除其他肝臟病史如肝移植病史，轉移性肝癌等。

1.3 主要儀器與試劑FPN抗體購自美國Abcam公司；普魯士藍鐵染色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司；免疫組化試劑購自安徽欣樂生物技術有限公司；人膜鐵轉運蛋白ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物技術公司。奧林巴斯CR23顯微鏡觀察免疫組化結果，Roche601電化學發光儀檢測甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)， KHB-ST-360酶標儀讀取FPN吸光度值，Siemens2000全自動生化儀檢測丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)水平，Mindray6800血常規分析儀檢測血紅蛋白(hemoglobin，Hb)水平。

1.4 方法

1.4.1普魯士藍鐵染色檢測肝癌組織鐵沉積 肝組織石蠟切片經二甲苯脫蠟兩次，用不同濃度梯度的乙醇(100%、95%、90%、85%)水化。Perls stain染液染色15～30 min，蒸餾水充分沖洗5～10 min后，伊紅染液復染15～30 s,蒸餾水沖洗3～5 s。最后乙醇(90%、95%、100%)脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。普魯士藍鐵染色結果判斷：無藍色鐵顆粒沉積為陰性，有藍色鐵顆粒沉積為陽性。

1.4.2免疫組化檢測FPN在肝組織中的表達 將石蠟組織切片在二甲苯中脫蠟，并根據標準方案在降序乙醇系列中再水合。在0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中在100 ℃下進行熱誘導的抗原修復20 min。酶消化的抗原修復在0.1%胰蛋白酶中于37 ℃進行25 min。然后用血清封閉切片30 min，然后與兔抗SLC40A1抗體在37 ℃溫育1～2 h。洗滌后，將切片與辣根過氧化物酶-山羊抗兔抗體在37 ℃溫育30 min。用DAB緩沖底物中的3,3-二氨基聯苯胺(DAB)溶液顯色過氧化物酶反應。用DAB顯示切片并用蘇木精復染，安裝在中性膠中并使用明視野顯微鏡分析。使用鼻咽癌病理切片作為陰性對照，并用PBS代替一抗。為了評估IHC結果，使用Image-J軟件對免疫組化結果進行分析判讀。

1.4.3ELISA檢測FPN在肝癌患者和正常健康對照者血清中的表達 將標準品工作液與待測樣品依次加入酶標板孔中每孔100 μl，覆膜，37 ℃孵育90 min；棄去液體不用洗滌，每孔直接加入生物素化抗體工作液100 μl，覆膜，37 ℃孵育60 min；甩盡孔內液體，每孔加入洗滌液350μl，浸泡1～2 min后拍干，重復洗滌3次；加入酶結合物工作液100 μl，覆膜，37 ℃孵育30 min，同上洗滌5次；每孔加入底物溶液90 μl，覆膜，37 ℃避光孵育15 min后加入終止液50 μl，終止反應，立即使用酶標儀在波長450 nm波長測量各孔OD值。

1.5 統計學處理采用SPSS 16.0統計軟件進行分析,其中正態數據采用均數和標準差表示，偏態數據采用中位數和四分位數間距表示，正態分布數據比較采用t檢驗，偏態分布數據采用秩和檢驗，檢驗水準α=0.05,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌患者肝組織中肝鐵沉積普魯士藍鐵染色結果顯示，肝癌組織中鐵沉積明顯高于肝良性病變組織(圖1)，肝癌組織出現明顯的藍色鐵沉積，而肝良性病變組織中無藍色鐵顆粒，以上結果提示肝癌患者較對照組織中出現鐵代謝紊亂，并發生肝鐵沉積現象。

圖1 HCC和肝良性病變組織普魯士藍鐵染色 ×200

2.2 FPN在血清中的表達水平健康對照組、慢性肝病組和肝癌組生化指標水平比較中顯發現ALT、AST、TBIL、Hb、FPN三組均有差異(表1)，且肝癌組患者血清中FPN表達水平明顯高于健康對照組和慢性肝病組(圖2)。再對肝癌患者進行臨床特征分析，發現患者的Child-pugh肝功能分級(P<0.05)，BCLC肝癌分期(P<0.05)，轉移(P<0.05)與FPN表達水平差異有統計學意義，與結節數目、腫瘤的大小(P>0.05)差異無統計學意義(表2)。

2.3 FPN在肝組織中的表達免疫結果顯示，肝良性病變組織中細胞膜和細胞質中無明顯的棕黃色染色，而肝癌組織細胞膜和細胞質中有明顯的棕黑色染色(圖3)，肝癌患者肝組織中FPN% Area中FPN(9.718±8.005)明顯高于肝良性病變患者肝組織中FPN% Area (2.669±2.231)，差異有統計學意義(t=2.361,P<0.05)。

表1 健康對照組、慢性肝病組和肝癌組生化指標水平比較[M(P25,P75)]

與健康對照組比較：#P<0.05；與慢性肝病組比較：*P<0.05

圖2 血清中FPN表達

與健康對照組比較：#P<0.05；與慢性肝病組比較：*P<0.05

表2 FPN與肝癌患者臨床特征的相關性[M(P25,P75)]

圖3 肝組織免疫組化染色

3 討論

我國是肝癌大國，每年新發病例和死亡病例都占到全球的50%以上。據統計，我國的肝癌患者，以巴塞羅那分期B和C期為主，占到所有肝癌患者的80%以上，C期在我國肝癌患者中占到50%以上，大多數肝癌患者發現時即為晚期，而早期肝癌的診出率不足30%，晚期肝癌的五年生存率不足20%，而及時進行規范治療后，早期肝癌的5年生存率已超過70%[4]。因此，尋找有效的靶基因對肝癌的早期診斷早期治療是尤為重要的。

人FPN基因位于2號染色體上，其mRNA編碼的FPN有571個氨基酸，分子量約62 000，在體內廣泛分布，在脾臟、肝臟、十二指腸、心臟等細胞中均有表達。肝臟中，FPN主要表達在枯否細胞的細胞質，肝細胞的竇周邊緣[5]。FPN是機體鐵代謝的重要調節因子，將細胞內游離鐵轉運至胞外，其變化會使腫瘤細胞更具侵襲性。因此，FPN異常引起的鐵代謝失衡通常會引起腫瘤侵襲和轉移。Geng et al[6]提出，敲低FPN可加速誘導神經母細胞瘤發生鐵死亡。Shan et al[7]發現，抑制FPN表達可刺激三陰性乳腺癌細胞的增殖、EMT和遷移。Wang et al[8]發現FPN與肝癌預后有一定的相關性。薛冬 等[9]發現FPN在前列腺癌細胞株和患者癌組織中均低表達，可能與其參與鐵調節相關，由此可見，FPN可能在腫瘤的發生發展中起到重要作用。

本研究首先通過普魯士藍鐵染色發現肝癌患者肝組織中已出現鐵沉積，表明肝癌患者體內已出現鐵紊亂現象，再通過免疫組化與ELISA分析出肝細胞癌患者體內肝組織和血清中FPN的表達均高于對照組(P<0.05)，進一步分析患者的臨床特征也得出FPN的表達程度與患者的Child-pugh肝功能分級，BCLC肝癌分期，轉移呈正相關。這與Wang et al[8]研究得出的肝癌患者組織中FPN低表達相矛盾，一方面可能由于肝臟發生鐵過載現象，機體反饋性的上調鐵調素的分泌水平，而FPN是已知的哺乳動物唯一的鐵輸出蛋白，需鐵調素結合，發揮作用，減少鐵的吸收，細胞內釋放鐵離子至血液減少，改善體內的鐵過載現象；另一方面，FPN在肝臟的亞細胞定位主要集中在枯否細胞胞質中，腫瘤細胞侵犯肝臟細胞時致使枯否細胞發揮吞噬和清除功能，FPN從胞質釋放進入血清[10-11]，導致FPN在肝癌患者體內高表達。

綜上所述，我們認為FPN在肝細胞癌的發生發展中起到重要作用，可作為肝細胞癌免疫治療的一個新的靶點。其機制可能是FPN作為鐵輸出的重要調節因子， 其mRNA可被高水平的細胞內鐵促進[11]，在肝細胞發生腫瘤時，細胞內鐵含量增高，鐵依賴的FPN表達增加，會將細胞內鐵轉移到細胞外，延緩細胞內鐵超載，因此細胞內鐵濃度升高會引發FPN補償性的負反饋調節，有利于肝細胞內鐵含量的穩定，從而保護組織免受鐵超載的傷害[5]，而鐵超載會使細胞內活性氧增加，可致腫瘤細胞發生鐵死亡，然而鐵死亡[12]作為一種新型的細胞死亡方式在肝細胞癌中起著重要作用[13-14]，FPN升高使得肝癌細胞逃避鐵死亡。但是FPN參與肝癌細胞鐵死亡的分子機制仍有待于研究。