CCL23-CCR1趨化因子軸在上皮性卵巢癌疾病進展中的作用

馮星浩，顏士杰，肖 蘭，魏兆蓮

卵巢癌(ovarian cancer，OC)最常見類型是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)。目前，腫瘤細胞減滅術及鉑類聯合紫杉醇的系統化療是卵巢癌國內外規范化治療的一線方案。因發病隱匿，70% EOC就診時已屬晚期，且易出現化療耐藥或復發。該研究通過抗體芯片，篩選出骨髓祖細胞抑制因子(myeloid progenitor inhibitory factor 1,MPIF-1)作為本研究的目的蛋白。MPIF-1又叫CCL23。研究表明外周血單核細胞中CCL23的表達水平與癌癥患者的進展和存活相關，并通過構建小鼠模型發現CCL23促進腫瘤細胞在轉移前器官中的存活，有助于乳腺癌細胞肺部轉移集落的形成[1]。為明確CCL23在上皮性卵巢癌發生發展中的功能，該研究采用ELISA、免疫組化及qRT-PCR方法檢測上皮性卵巢癌患者血清CCL23濃度及原位病灶組織中的CCL23基因和蛋白表達水平。

1 材料與方法

1.1 病例資料調取安徽醫科大學第一附屬醫院病理科2010年1月-2015年1月首次診斷為上皮性卵巢癌患者的石蠟切片，根據2014年國際婦產科聯盟卵巢癌分期標準(FIGO)進行病理分期，選取其中Ⅰ期20例，Ⅱ期20例，Ⅲ期40例，Ⅳ期20例，術前未接受新輔助化療或免疫治療，另取正常卵巢組織10例，漿液性卵巢瘤及交界性卵巢瘤，各20例，作為對照，其中正常卵巢組織來源于圍絕經期因“子宮肌瘤”行子宮及雙側附件切除術的患者。

1.2 組織保存采用RNaFixer無液氮RNA樣品儲存液保存卵巢組織。組織標本入組標準：于該院首次診斷為上皮性卵巢癌患者，術前未接受新輔助化療或免疫治療，于手術日待手術標本取下，使用PBS沖洗組織3次，洗去組織上的血液，迅速將新鮮組織剪成長、寬、高任意一邊厚度<0.5 cm浸泡入RNaFixer，新鮮組織浸泡于5倍體積的RNaFixer中，4 ℃過夜，后轉移至-20 ℃長期保存。樣品使用時可以在室溫融化，研磨勻漿進行下一步RNA提取。

1.3 試劑TRIzol試劑購自美國InvitroGen公司；RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；RNaFixer無液氮RNA樣品儲存液購自北京普魯頓生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自美國MyBioSource公司；通用型SP9000試劑盒購自福建邁新公司；細胞因子抗體芯片檢測試劑盒購自美國RayBiotech公司；化學發光法檢測試劑盒購自英國Amersham Phaimacia生物科技有限公司。

1.4 抗體芯片技術抗體蛋白質檢測結果見圖1，操作過程按試劑盒說明書進行并略作修飾。具體步驟為：將已包被抗體的蛋白質芯片膜包被于BSA緩沖液室溫孵育30 min，以阻斷非特異性反應，然后將膜與培養液于搖床上室溫孵育4 h,緩慢搖動，使反應均勻，充分洗膜，洗去非特異性結合物，加2 ml生物素結合的抗體，4 ℃孵育過夜，再次徹底洗膜，加辣根過氧化物酶結合的鏈霉親和素，室溫孵育4 h，充分洗膜，使用化學發光法檢測試劑盒和UVP化學信號圖像系統顯色，照相，使用Ray Biotech INC抗體芯片分析工具軟件對所有原始數據(光點密度)根據單個膜陽性與陰性對照值進行標準化處理及減除背景處理，再進行組間比較。

1.5ELISA采用ELISA檢測血清中CCL23的濃度。于手術日早晨取患者空腹血于抗凝管中，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清液于無酶EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存，行ELISA前置于冰上解凍，渦旋混勻。標準孔中加入50 μl標準品，實驗孔中加入10 μl血清樣本及40 μl樣本稀釋液毎孔中加入100 μl HRP試劑，37 ℃溫箱中孵育1 h，wash buffer清洗孔4次洗去非特異性結合，分別向毎孔中加入50 μl A顯色液和50 μl B顯色液，37 ℃溫箱中孵育15 min，毎孔中分別加入50 μl終止液，酶標儀上立即測定450 nm處吸光度值。根據標準孔的吸光度值建立標準曲線，計算實驗孔對應血清CCL23濃度。

1.6 實時熒光定量PCRTRIzol冰上裂解組織5 min，待組織及細胞充分溶解，加入200 μl氯仿，上下振搖EP管，冰上放置3 min后，4 ℃、7 500 r/min離心15 min后，取上層水相轉移至另一個EP管中，加入500 μl異丙醇，充分混勻，冰上放置10 min,4 ℃、7 500 r/min離心10 min,去上清液，加入含DEPC的70%乙醇1 ml混勻洗滌后，4 ℃、3 125 r/min 離心10 min,重復洗滌3次，用DEPC水溶解RNA沉淀，立即測定RNA濃度和純度，將提取的RNA逆轉錄(RT)合成cDNA等操作方法均嚴格遵照試劑盒說明書進行。CCL23基因引物序列(5′-3′)，上游：GCTGACTGCTGCATCTCCTACAC；下游：GGCTTGGAGCACTCGCTGTTC。內參18S基因的引物序列(5′-3′)，上游：CATCTTCTTTTGCGTCGCCA；下游：TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC。PCR反應體系為20 μl，反應條件95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40次循環。每個樣品均設3個復孔，采用2-ΔΔct計算各目的基因mRNA的表達水平，其中Ct值為循環閾值。

1.7 免疫組化石蠟切片采用免疫組化SP法檢測蛋白表達水平。組織標本切片置于65 ℃烤箱中烘烤1 h后，立即置于二甲苯中15 min，梯度乙醇脫水，PBS浸洗3次，室溫條件下0.3% Triton X-100通透30 min，行改良檸檬酸鹽修復液高壓修復20 min，待冷卻至室溫，使用3%過氧化物酶阻斷劑37 ℃封閉30 min，PBS浸洗3次，山羊血清37 ℃封閉1 h，輕輕甩去血清，一抗CCR1按1 ∶50稀釋，陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，4 ℃過夜，PBS浸洗3次，二抗37 ℃孵育30 min后，PBS浸洗3次，三抗37 ℃孵育30 min，后DAB顯色，結果判定標準本研究組中組織標本切片SP法檢測結果均有兩名本院資深病理科醫師閱片后判定。以細胞膜或細胞質出現黃色或者棕褐色顆粒者為陽性細胞，根據每份標本中的陽性細胞所和染色強度所占百分比進行評分及分組。CCR1豐度的半定量采用Image Pro Plus 6.0進行平均光密度值分析。按照癌細胞陽性細胞占比分為四個等級，其中高表達(癌細胞陽性表達占比>80%)；中度表達(癌細胞陽性表達占比40%～80%)；低表達(癌細胞陽性表達<40%)及陰性表達組。

2 結果

2.1 對照組和上皮性卵巢癌患者組血清中CCL23的濃度課題組前期通過對比4例成年正常女性血清和6例上皮性卵巢癌患者血清中441 種炎性因子表達水平，篩選出趨化因子CCL23差異表達；并進一步在22例正常成年女性及36例上皮性卵巢癌患者血清中進行驗證，22例成年正常女性年齡40～63(53.80±8.20)歲，血清CCL23表達水平(1 157.80±457.40)pg/ml，36例上皮性卵巢癌患者年齡43～65(54.00±10.80)歲，血清CCL23表達水平(1 654.90±849.00)pg/ml。實驗組患者年齡略高于正常對照組年齡，差異無統計學意義(t=0.095,P=0.925)。實驗組血清CCL23水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(t=-2.443，P=0.018 8)，見圖1。

2.2 對照組和上皮性卵巢癌患者組原位病灶中CCL23及CCR1的表達6例成年正常女性卵巢上皮組織中CCL23 mRNA表達水平(1.70±0.45)，6例上皮性卵巢癌患者原位病灶組織中CCL23 mRNA表達水平(12.99±2.88)，差異有統計學意義(t=-7.515,P=0.006)。此外，課題組通過免疫組化法證明CCR1在正常卵巢生發上皮(ovarian surface epithelial, OSE)呈陰性表達，見圖2。經過光密度分析，在Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌石蠟切片中CCR1陽性表達較Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌表達升高，差異有統計學意義(t=-4.403,P=0.000 6)。其中Ⅲ/Ⅳ期上皮性卵巢癌共60例，平均光密度值(1.77±0.15)，Ⅰ/Ⅱ期共40例，平均光密度值(0.85±0.13)，見圖3。

圖1 趨化因子CCL23抗體芯片檢查結果1～4：正常對照組；5～10：上皮性卵巢癌組患者

3 討論

趨化因子家族是一個極其復雜的網絡，促炎機制可用來有效解釋排卵次數增多、子宮內膜異位癥、接觸滑石粉和石棉可增加卵巢癌患病風險。Trabert et al[2]在一項對前列腺癌、肺癌、結腸癌和卵巢癌的巢式病例對照研究中，通過比較149例卵巢癌患者血清和149例對照組血清發現，急性C反應蛋白、細胞因子IL-1α、IL-8、TNF-α，與卵巢癌患病風險呈正相關。血清趨化因子水平也可能成為惡性腫瘤的敏感預后指標之一。本課題組通過蛋白質芯片工具對比4例成年正常女性血清和6例上皮性卵巢癌患者血清中441種炎性因子表達水平，篩選出趨化因子CCL23差異表達。并進一步在22例成年正常女性及36例上皮性卵巢癌患者血清中進行驗證，提示上皮性卵巢癌組患者血清CCL23濃度明顯高于正常對照組，CCL23可能成為一種新的上皮性卵巢癌患者標志物。

腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)和改善上皮性惡性腫瘤不良預后相關。Bronger et al[3]通過體外實驗發現，CXCL9和CXCL10利于TILs在上皮性卵巢癌腫瘤內的募集，從而發揮TILs的抑癌功能。K Au et al[4]在ID8同系小鼠高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer, HGSOC)模型中發現，CXCL10表達的增加可減少小鼠腫瘤負荷和惡性腹水量，而在ID8過表達CXCL10小鼠移植瘤模型中，腹水VEGF和IL-6水平明顯降低，CXCL10在HGSC腫瘤微環境中起著積極的作用。Rainczuk et al[5]在135例漿液性卵巢癌患者臨床樣本中發現，HGSOC可以表達CXCL10的拮抗物，干擾腫瘤中TILs的募集，從而導致患者的不良預后。Dangaj et al[6]研究表明，實體腫瘤來源的CCL5和經髓細胞來源的IFN-γ誘導的CXCR3之間的相互作用，精細地調節TILs的浸潤過程。本課題組目前實驗結果提示上皮性卵巢癌病灶可能產生趨化因子，并且同時表達趨化因子受體，可能通過自分泌作用方式形成正反饋，從而直接參與腫瘤的發生及惡性生物學行為，但目前尚未建立可信的模型進行驗證。

圖2 免疫組化檢測正常對照組、漿液性囊腺瘤組、交界性腫瘤組中CCR1的表達

A：正常對照組；1、2中箭頭所示為正常OSE；1：200×視野圖例；2、3：400×視野圖例；B：漿液性囊腺瘤組；B2中箭頭所示為纖維結締組織內襯漿液性單層柱狀上皮；C：交界性腫瘤組；C2中箭頭所示見漿液性上皮復層化；3：HE染色

腫瘤微環境中的趨化因子表達譜可改變癌細胞的生物學行為，癌細胞能夠響應趨化因子刺激。Ding et al[7]通過人群及體外細胞學實驗研究表明，腫瘤相關巨噬細胞可以通過分泌CCL5，促進胃癌的發展和轉移；越來越多的研究表明腹腔微環境與上皮性卵巢癌腹腔轉移相關。Lane et al[8]等使用ELISA檢測53例上皮性卵巢癌、24例卵巢良性腫瘤腹水，發現晚期漿液性卵巢癌腹水中CCL18水平明顯升高，并在體外實驗中發現癌性腹水和CCL18可以劑量依賴性的增加卵巢癌細胞系CaOV3和OVCAR3的轉移能力。Peng et al[9]證實腫瘤相關間皮細胞(cancer associated mesothelial, TAM)具有促腫瘤活性，并通過體外實驗證實纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)通過誘導CAM的形成，CAFs釋放IL-8和CXCL5進一步促進卵巢癌細胞的轉移。Zhao et al[10]通過免疫組化對比58例漿液性卵巢癌和25例卵巢正常上皮中CXCL14的表達，發現腫瘤相關成纖維細胞(cancer associated fibroblast, CAF)中高表達CXCL14與患者不良預后相關，在體外實驗中，CAF高表達CXCL14，可上調長連非編碼RNA LINC00092, 從而促進卵巢癌的進展。該研究使用qRT-PCR方法發現上皮性卵巢癌患者組原位病灶組織中CCL23基因的表達水平明顯增高，提示該基因可能參與調控上皮性卵巢癌的進展。為了解CCL23-CCR1在上皮性卵巢癌疾病進展中的作用，課題組使用免疫組化的方法，發現正常OSE中CCR1呈陰性表達，而上皮性卵巢癌原位病灶組織中CCR1呈陽性表達，并且CCR1在Ⅲ/Ⅳ期上皮性卵巢癌中的表達明顯高于Ⅰ/Ⅱ期，提示CCL23-CCR1趨化因子軸可能在上皮性卵巢癌疾病進展中作用。但本研究并沒有證明趨化因子CCL23直接作用于受體CCR1，從而促進上皮性卵巢癌的進展，這些需在后續實驗中進一步證明。目前，關于CCL23基因過表達對上皮性卵巢癌的影響尚不明確，計劃后續繼續開展相應功能試驗，并對上皮性卵巢癌患者對應網膜轉移病灶中CCL23的表達進行相關檢測，進一步證明CCL23/CCR1軸在上皮性卵巢癌網膜轉移中的作用。

A：200×視野圖例；B：400×視野圖例；C：400×HE染色圖例；1：Ⅰ期；2：Ⅱ期；3：Ⅲ期；4：Ⅳ期；D：各期別上皮性卵巢癌按照低、中、高表達分組后所占百分比圖例；E：半定量分析Ⅲ/Ⅳ期組織中CCR1表達；與Ⅰ/Ⅱ期比較：*P<0.05

綜上，趨化因子CCL23在上皮性卵巢癌患者和正常成年女性中存在差異表達，上皮性卵巢細胞可能通過自分泌作用形式形成正反饋，從而促進腫瘤細胞的存活。目前，CCL23基因作用機制的研究尚處于起始階段，其參與上皮性卵巢癌的發生、發展的機制及作用有待于進一步探索。