生酮飲食對高原低氧環(huán)境下小鼠海馬神經元損傷的保護作用

鐘 婷，李 琴，白芙蓉，卿 羽，劉英海，古學東，吳 畏

我國高原地區(qū)地域遼闊，自然環(huán)境惡劣，其中低壓、低氧、寒冷、輻射強等特點都對高原人群生命健康產生很大影響 。當從平原地區(qū)進入高原地區(qū)時，隨著海拔升高，大氣氧分壓降低，機體攝入氧不足而導致組織缺氧，其中大腦對缺氧耐受能力最差，可造成不同程度的腦組織損傷，甚至造成認知、情緒及神經心理上的損傷，嚴重者可發(fā)生高原性腦水腫而危及生命[1]。因此尋找一種有效可行的干預方法保護高原低氧性腦損傷具有重要意義。生酮飲食是一種高脂肪、低碳水化合物飲食，最初是難治性癲癇的有效治療手段。給予生酮飲食時，糖的來源受限，脂肪酸成為了人體的主要供能物質[2]，脂肪酸在肝臟代謝時產生的特殊產物——酮體，包括乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮，可以自由穿過血腦屏障，為腦組織提供必須的能量。該研究通過模擬高原低氧環(huán)境，觀察生酮飲食預處理對高原低氧環(huán)境下小鼠海馬神經元損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飲食雄性C57BL/6小鼠(8～9周，18～20 g)由成都達碩實驗動物有限公司提供。小鼠隨機分為常氧對照(NC)組、常氧生酮(NK)組、低氧對照(HC)組和低氧生酮(HK)組，每組11只。小鼠給予標準飲食(購買于成都達碩實驗動物有限公司)或生酮飲食(每100 g食物中含脂肪67.2 g，蛋白質17.6 g，碳水化合物0.2 g，購買于美國Research Diets公司)，各組小鼠禁食過夜后分別接受上述飲食3周，實驗期間小鼠自由飲水和攝食，飼養(yǎng)于常壓常氧的飼養(yǎng)室中(成都海拔約500 m)，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度控制在22～24 ℃，濕度控制在40%～50%。

1.2 實驗主要試劑兔抗線粒體融合蛋白1(mitochondrial fusion protein 1, MFN1)、兔抗線粒體分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1, FIS1)(Protein tech)，鼠抗β- actin(Santa Cruz)；山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗(CST)。

1.3 實驗方法

1.3.1低氧環(huán)境的建立 采用低壓氧艙(中國貴州風雷)，模擬海拔高度6 000 m，艙內溫度22～24 ℃，艙內濕度40%～50%，運行時間為24 h/d，晝夜比12 h ∶12 h，持續(xù)6 d。HC組和HK組小鼠置于低壓氧艙中，每天早上9點取出小鼠，更換水和食物，觀察小鼠情況，30 min后繼續(xù)放回低壓氧艙。NC組和NK組置于艙外(成都海拔約500 m)飼養(yǎng)。

1.3.2取材與標本制作 持續(xù)低氧6 d后，每組隨機選取4只小鼠，戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，4%多聚甲醛心內灌注固定后開顱，取出腦組織，放入固定液(10%福爾馬林)中進行固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，用于尼氏染色。每組隨機選取4只小鼠斷頭處死，冰上快速分離海馬，-80 ℃冰箱保存，用于Western blot實驗。各組剩余小鼠斷頭處死，冰上快速分離腦組織，立即做Seahorse實驗。

1.3.3尼氏染色 石蠟切片脫蠟至水，常規(guī)甲苯胺藍染色，光學顯微鏡下觀察小鼠海馬組織CA1、CA3區(qū)、齒狀回部位的病理學改變。

1.3.4蛋白印跡法(Western blot) 將加入細胞裂解液的海馬組織在冰上勻漿，待其充分裂解后離心15 min，取上清液進行蛋白定量及蛋白樣品制備。常規(guī)電泳、轉膜(PVDF膜)、5%脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育一抗過夜：兔抗MFN1 (1 ∶1 000)、兔抗FIS1(1 ∶1 000)，室溫孵育二抗(1 ∶20 000)1 h，結果用LI-COR遠紅外成像系統(tǒng)掃描。

1.3.5Seahorse實驗 提取新鮮的小鼠腦組織線粒體加入Seahorse XF24孔板，以分別向探針板A、B、C、D孔加入二磷酸腺苷(ADP)、寡霉素(Oligomycin)、羧基-氰-對三氟甲氧基(FCCP)、抗霉素/魚藤酮(Antimycin A/Rotenone)，校正探針板后，將孔板置于Seahorse XF24生物能量代謝分析儀中進行檢測。

2 結果

2.1 生酮飲食及高原低氧環(huán)境下小鼠海馬組織的病理學改變尼氏染色結果顯示，NC組小鼠海馬組織神經元細胞(CA1、CA3區(qū)、齒狀回部位)排列整齊，染色均一。與NC組相比，HC組海馬CA1、CA3區(qū)細胞排列疏松，細胞數量減少，著色較淺，齒狀回部位細胞核固縮深染。與HC組相比，HK組海馬CA1、CA3區(qū)細胞排列逐漸整齊，細胞數量逐漸增多，齒狀回部位核固縮深染的細胞數量逐漸減少(圖1)。以上結果說明生酮飲食能有效改善高原低氧環(huán)境下小鼠海馬神經元的損傷。

2.2 生酮飲食及高原低氧環(huán)境下小鼠海馬組織線粒體分裂/融合相關蛋白的表達變化Western blot 結果顯示，與NC組相比，HC組的MFN1表達降低(F=7.43,P<0.05)，F(xiàn)IS1表達增加(F=8.22,P<0.05)。與HC組相比，HK組的MFN1表達增加(F=8.22,P<0.05)，F(xiàn)IS1表達降低(F=8.73,P<0.05)(圖2)。說明高原低氧環(huán)境降低了海馬組織線粒體的融合能力而促進了線粒體的分裂。給予生酮飲食后，低氧環(huán)境下海馬組織線粒體的融合能力相對提高，線粒體的分裂相對減少，線粒體的功能相對改善。

圖1 生酮飲食調節(jié)高原低氧環(huán)境下各組小鼠海馬組織形態(tài)結構的變化(尼氏染色)

2.3 生酮飲食調節(jié)高原低氧環(huán)境下小鼠腦組織線粒體的耗氧率(OCR)Seahorse結果顯示，與NC組(271.95±90.87)相比，HC組(142.68±69.99)中由ADP刺激引起的線粒體耗氧率降低(F=15.54,P<0.01)；與HC組相比，HK組(207.51±89.55)中由ADP刺激引起的線粒體耗氧率增加(F=7.76,P<0.05)。由FCCP刺激引起的線粒體耗氧率，與NC組(229.76±51.82)相比，HC組(147.77±39.55)降低(F=13.64,P<0.05)；與HC組相比，HK組(200.28±60.22)增加，差異無統(tǒng)計學意義(圖3)。說明生酮飲食可以增加低氧環(huán)境下小鼠腦組織線粒體的耗氧率，即提高線粒體的氧化呼吸能力，從而改善線粒體功能。

4 討論

有關研究[3]表明，高原低氧環(huán)境可以造成不同程度的腦組織損傷而導致感知、判斷、注意力和記憶力等認知功能受損。Nation et al[4]發(fā)現(xiàn)當飛行員急性暴露于模擬高空低氧環(huán)境時可造成學習和記憶能力的快速損傷。Zheng et al[5]發(fā)現(xiàn)將小鼠置于模擬海拔6 100米的低壓氧艙內7 d后小鼠的記憶和認知能力下降。大腦對低氧環(huán)境極不耐受，其中參與感知、情緒、學習和記憶等認知過程的海馬組織對低氧又非常敏感，高原低氧環(huán)境可以造成海馬神經元的損傷，從而導致大腦認知功能障礙，可能與海馬神經元氧化應激、病理性損傷、細胞凋亡等有關[6-7]。本研究通過模擬6 000米海拔高度下的高原低氧環(huán)境亦發(fā)現(xiàn)了小鼠海馬神經元病理性損傷的發(fā)生，低氧對照組小鼠海馬神經元出現(xiàn)細胞排列紊亂、細胞數量減少、核固縮深染等凋亡或壞死的病理學改變，但是小鼠在此低氧環(huán)境下是否發(fā)生由海馬神經元損傷導致的認知功能障礙還需要更多實驗證明。

近些年來，對生酮飲食的研究熱點主要聚焦于其對肥胖、2型糖尿病等糖脂代謝性疾病方面潛在的獲益和臨床價值[8]。研究[9]表明，生酮飲食可以改善心臟功能、延長壽命、改善記憶功能。Lee et al[10]發(fā)現(xiàn)外源性β-羥丁酸可以對缺血缺氧性腦病乳鼠模型產生神經保護作用，也有研究[11]表明生酮飲食可以作為組蛋白去乙酰酶復合物抑制劑上調腦源性神經營養(yǎng)因子BDNF而改善低氧認知功能障礙。所以，生酮飲食用于癲癇、腦卒中等疾病時可以觀察到其神經保護作用，但對高原低氧性腦損傷的作用研究較少。本實驗在高原低氧前給予小鼠生酮飲食，減輕了小鼠海馬神經元病理性損傷，提示生酮飲食可以改善高原低氧環(huán)境下小鼠海馬組織病理性損傷和結構變化，從而發(fā)揮保護作用。

為了進一步探討生酮飲食對低氧環(huán)境下小鼠海馬神經元損傷的保護作用，本實驗研究了生酮飲食對低氧環(huán)境下小鼠海馬神經元的線粒體功能的改變。線粒體是機體能量代謝的細胞器，其數量及形態(tài)具有高度可塑性，各種外界刺激都會促使其移動、合成、分裂、融合，其中，線粒體分裂/融合動態(tài)平衡在細胞代謝過程中或遭受應激過程中對線粒體質量和功能的維護扮演著重要角色[12]。線粒體的分裂能夠使線粒體片段化，破壞線粒體的完整性，由分裂蛋白Drp1和Fis1調節(jié)。線粒體融合能夠通過融合蛋白MFN1、MFN2和OPA1調節(jié)促進不同程度受損的線粒體之間相互融合而得到修復，減少損傷的線粒體，改善線粒體功能。有研究[13]顯示線粒體受損時，線粒體動力學功能障礙而導致線粒體分裂增加，可以導致促凋亡因子的釋放，最終導致細胞凋亡，而Guo et al[14]在缺血性腦病模型中發(fā)現(xiàn)生酮飲食可以抑制線粒體分裂并保護線粒體完整性從而發(fā)揮神經保護作用。本實驗在高原低氧環(huán)境下觀察到小鼠海馬神經元線粒體分裂/融合失衡，線粒體分裂增加，線粒體完整性被破壞，有可能因此誘發(fā)海馬神經元的凋亡而導致海馬組織結構改變。給予生酮飲食后低氧暴露，結果發(fā)現(xiàn)線粒體融合增加，受損的線粒體彼此融合而節(jié)約能量代謝底物，從而改善了線粒體功能，改善了海馬神經元的損傷。因此，高原低氧環(huán)境下小鼠海馬神經元線粒體分裂/融合失衡在海馬組織損傷和結構改變中起重要作用，而生酮飲食可能通過改善線粒體分裂/融合失衡，從而發(fā)揮腦保護作用。

線粒體還是細胞氧化磷酸化和產生ATP為機體的生命活動提供能量的重要場所，低氧環(huán)境下，線粒體氧化磷酸化和電子鏈的傳遞受限，導致ATP產生減少，ROS產生增多，可能進一步誘導細胞凋亡[15]。線粒體的氧化呼吸能力可以由Seahorse檢測線粒體耗氧率來評估，本實驗中給予ADP刺激和給予FCCP刺激后，HC組較NC組耗氧率降低，HK組較HC組耗氧率增加，可以提示高原低氧環(huán)境下小鼠腦組織線粒體氧化呼吸能力的降低，而生酮飲食可以改善高原低氧下線粒體氧化呼吸能力。我們觀察到，給予FCCP刺激后，HK組較HC組耗氧率增加的結果沒有明顯的統(tǒng)計學差異，可能是因為樣本數量較少，以及在低氧環(huán)境和生酮飲食條件下，海馬神經元細胞線粒體糖酵解能力的變化，還需要進一步的實驗證明。

綜上，本研究顯示生酮飲食能改善高原低氧環(huán)境下小鼠海馬神經元的損傷，并通過改善海馬神經元線粒體分裂/融合失衡和線粒體氧化呼吸功能，進而改善海馬組織結構和能量代謝，減輕腦組織損傷，發(fā)揮腦保護作用。