基于CRISPR/Cas9構建小鼠UOX基因敲除模型

張茹君 夏海林 朱赟 黃晶 孟雨菡

[摘要] 目的 通過 CRISPR/Cas9獲得UOX基因敲除的小鼠純合品系，為建立高尿酸血小鼠動物模型奠定基礎。方法根據小鼠 UOX 基因第三外顯子前后兩個位點設計雙sgRNA，通過PCR、體外轉錄和純化獲得sgRNA和Cas9 mRNA。將sgRNA和Cas9 mRNA顯微注射進小鼠原核胚后，體外培養至二細胞胚階段，進行胚胎移植至代孕母鼠。F0代小鼠出生后，提取其DNA進行電泳分析和測序分析。F0代交配繁殖至F2代獲得UOX缺失的小鼠純合品系。 結果 顯微注射sgRNA和Cas mRNA至原核胚，成功獲得50枚囊胚。移植后生育17只幼鼠。其中，有 8只小鼠UOX基因缺失突變，突變率為47.06 %。成功構建了UOX缺失的小鼠純合品系。 結論 利用 CRISPR/Cas9，成功獲得 UOX缺失的小鼠胚胎和純合品系，為CRISPR/Cas9獲得高尿酸血的小鼠動物模型奠定基礎。

[關鍵詞] CRISPR/Cas9;UOX;基因編輯;高尿酸;動物模型

[中圖分類號] R4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2020）03（a）-0032-04

Construction of Mouse UOX Gene Knockout Model Based on CRISPR / Cas9

ZHANG Ru-jun1， XIA Hai-lin1， ZHU Yun2， HUANG Jing3， MENG Yu-han2

1.Changzhou Cavens Experimental Animal Co.， Ltd.， Changzhou， Jiangsu Province， 213104 China;2.Jiangsu Kebiao Medical Testing Co.， Ltd.， Changzhou，Jiangsu Province， 213461 China;3.Baige Gene Technology （Jiangsu） Co.， Ltd.，Chang zhou， Jiangsu Province， 213000 China

[Abstract] Objective To obtain homozygous strains of UOX knockout mice by CRISPR / Cas9， and to lay the foundation for establishing an animal model of hyperuricemia mice. Methods Double sgRNA was designed based on two sites before and after the third exon of mouse UOX gene， and sgRNA and Cas9 mRNA were obtained by PCR， in vitro transcription and purification. After microinjection of sgRNA and Cas9 mRNA into mouse prokaryotic embryos， they were cultured in vitro to the two-cell embryo stage， and embryos were transferred to surrogate mother rats. After F0 mice were born， their DNA was extracted for electrophoretic analysis and sequencing analysis. FOX generations were bred to F2 generations to obtain UOX-deficient mouse homozygous lines. Results Microinjection of sgRNA and Cas mRNA into prokaryotic embryos successfully obtained 50 blastocysts. After transplantation， 17 young rats were born. Among them， 8 mice had UOX gene deletion mutations， and the mutation rate was 47.06%. A homozygous mouse line lacking UOX was successfully constructed. Conclusion UCRISPR-deficient mouse embryos and homozygous strains were successfully obtained using CRISPR / Cas9， laying a foundation for CRISPR / Cas9 to obtain hyperuricemia mouse animal models.

[Key words] CRISPR / Cas9; UOX; Gene editing; Hyperuricemia; Animal model

高尿酸血癥（hyperuricemia）是由嘌呤代謝紊亂，尿酸排泄障礙引起的血尿酸異常為臨床表現的異質性疾病。尿酸病理性升高有5%～12%的風險導致尿酸結晶累積并損傷關節[1]，引起痛風、急性及慢性關節炎等。并且，高尿酸血癥易引發并發癥，如高血壓、高血脂、2型糖尿病、冠心病。臨床上常規的高尿酸血癥及痛風治療手段為口服降尿酸藥物[2]，目前尚未有根治痛風的藥物，新型降尿酸藥物開發需要利用高尿酸動物模型進行降尿酸藥物藥效及藥理篩選。故建立穩定性好，更接近患者發病特征的高尿酸動物模型，能提高新型降尿酸藥物開發效率及成藥性，優化痛風治療格局。近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術憑借其簡便性、特異性和高效性，在疾病動物模型構建領域應用日趨廣泛和深入。該研究利用CRISPR/Cas9，敲除小鼠基因組內尿酸氧化酶（Urate Oxidase，UOX）基因，以誘導小鼠尿酸分解障礙，為建立高尿酸血小鼠動物模型奠定基礎，現報道如下。

1? 材料與設備

1.1? 實驗動物及飼料

實驗動物為野生型C57BL/6健康雌鼠（SPF 級，3～4周齡）;野生型雄性C57BL/6健康小鼠（SPF 級，6～8 周齡，體重 30 ～ 35 g），均來自并飼養于常州卡文斯實驗動物有限公司【SCXK（蘇）2016-0010】。飼養環境 SPF 級環境，12 h 交替晝夜，溫度（22±4）℃，濕度（55±10）%。適應飼養時間1周。試驗方案通過實驗動物倫理學審查。

1.2? 實驗試劑

px330-Cas9、px330-sgRNA來自Addgene公司。QIAQuick PCR purification kit來自Qiagen公司。TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit來自Thermo公司（型號：K0441）。TA Cloning kit 來自Invitrogen。水（Nuclease-free）、MEGAshortscript T7 kit、mMESSAG EmMACHINE T7 kit和MEGAclear kit來自Life Technologies公司。β-巰基乙醇、DMSO 、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）、血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）。

1.3? 實驗儀器

倒置顯微鏡（Olympus，型號：IX73號）;顯微操作裝置（Narishige，型號：MMO-202ND）;電壓沖擊驅動系統（Primer Tech，型號：PMM-150FU）;二氧化碳培養箱（Thermo，型號：BB15）;SZX7立體顯微鏡（Olympus，型號：SZX7）。

2? 方法

2.1? 引物設計

在Uox基因（NCBI Gene ID ：22262）第三號外顯子功能域的前部和后部分別設計兩條sgRNA，根據sgRNA結構設計PCR上游引物 Uox-sgRNA-1、Uox-sgRNA-2，下游引物T7SG-R0。引物序列見表1。

2.2? 制備sgRNA轉錄模板

分別按表2混合以下試劑，進行兩次PCR擴增sgRNA模板。反應條件均為98 ℃預變性 5 min;按循環程序（98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）進行35個循環;72 ℃延伸 5 min。反應產物取 50 μL 進行 2 %瓊脂糖凝膠電泳，判斷PCR 結果。回收DNA。

2.3? sgRNA的體外轉錄

按表3混合sgRNA體外轉錄反應體系。混勻后，37℃孵育2 h。加DNase 1 μL，37℃孵育15 min;純化，分裝，-80℃保存。

2.4? Cas9 mRNA的體外轉錄

按表4混合Cas9 mRNA PCR反應體系。正向引物序列為5`-TTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC-3`，反向引物序列為5`-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3`。混勻后，反應條件同2.2，反應產物取 50 μL 進行 2 %瓊脂糖凝膠電泳，判斷PCR結果。回收DNA。

用QIAQuick PCR purification kit純化膠內Cas9 PCR產物，用mMESSAGEmMACHINE T7 kit試劑盒體外轉錄Cas9 mRNA。用MEGAclear kit純化Cas9 mRNA。

2.5? UOX突變小鼠胚胎的獲得

向若干只雌性C57BL/6小鼠注射5 IU PMSG，48 h后注射10 IU hCG，與雄性C57BL/6小鼠合籠一夜。hCG注射后約20 h，對見栓雌鼠實施安樂死收集卵丘細胞復合體。

將卵丘細胞復合體移入M2+透明質酸酶培養基中洗滌數次，胚胎置于37℃的KSOM培養基（用礦物油覆蓋）5%CO2培養。在顯微鏡下用顯微注射針向原核胚內注射Cas9 mRNA（100 ng/μL）和UOX-sgRNA（50 ng/μL），繼續培養胚胎24 h至兩細胞胚。

2.6? 胚胎移植

結扎雄鼠與發情的C57BL/6雌鼠合籠，次日選擇見栓0.5 d的雌鼠作為代孕母鼠。在體視顯微鏡下，從代孕母鼠背部找到輸卵管，將胚胎移從輸卵管移植入子宮。代孕母鼠手術縫合，放入培養間培養觀察。

2.7? UOX—小鼠鑒定

代孕母鼠3周后生產F0代小鼠。出生后3周雄性和雌性F0代小鼠分開飼養。取出生后3周F0代小鼠尾尖血，用DNeasy blood and tissue kit 提取基因組DNA，PCR驗證基因敲除情況，驗證序列見表5，PCR擴增體系見表6。PCR反應條件為95 ℃預變性 5 min;按循環程序（ 95℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 40 s）進行30個循環;68 ℃延伸 5 min。用QIAQuick PCR purification kit 純化PCR產物，用TA Cloning kit 克隆，反應產物測序。

2.8? UOX—小鼠純合品系構建

將 F0 代的基因敲除小鼠與野生型小鼠交配獲得后代F1，對F1 代小鼠進行突變分析。選擇突變的 F1 代雜合雌鼠和雄鼠交配獲得后代F2，對F2 代小鼠進行突變分析。對F2代中純合小鼠進行交配，以構建UOX—小鼠品系

3? 結果

3.1? F0代小鼠的獲得

該研究兩細胞胚率為81.7%（58/71），顯微注射了Cas9 蛋白和UOX-sgRNA的胚胎移植至58個兩細胞胚。將50個囊胚移植到2只代孕母鼠子宮，2只均懷孕，共生產17 只小鼠，出生率為34.0%（17/50）。F0代小鼠外觀正常，健康狀態良好，均無外傷或感染發生。

3.2? UOX—小鼠鑒定結果

sgRNA轉錄模板經擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶消失（圖1），F0代小鼠鼠尾DNA測序結果顯示，其中8只小鼠的 UOX基因被敲除，突變率為47.06%。突變小鼠的測序圖見圖2。8只UOX—小鼠與未突變小鼠外觀無差異。

4? 討論

高尿酸血癥約80%源于內源性尿酸代謝紊亂[3]。高尿酸血癥患者體內嘌呤單鈉尿酸鹽（purine monosodium urate，MSU）在關節異常累積，會引起痛風。痛風嚴重影響患者生存質量，會導致痛風石沉積、關節炎反復發作和關節畸變[4]。據報道，中國成年人群痛風的校正患病率達 8.4%[5]。2017年中國痛風患者從2009年的9000萬人增長至2017年的1.8億人。并且，痛風可加重腎臟病變，增加高脂血癥、高血壓病的發病率[6-7]。故痛風嚴重影響中國社會發展，研究高尿酸血癥和痛風的治療藥物及其藥物篩選的動物模型，具有顯著的臨床意義及社會價值。

利用基因組靶向編輯技術制備動物模型是當今研究的熱點及前沿領域。CRISPR/Cas9系統具有定位靶向基因組的高效率，轉染多個sgRNA的高成功率的優勢，成為廣泛使用的基因編輯技術之一，已應用于構建各種疾病的動物模型，如神經退行性疾病[9]，腫瘤[10]等。CRISPR-Cas系統源于大腸桿菌獲得性免疫系統，主要部件為RNA引導的有規則間隔的短回文重復序列sgRNA[11]。通過sgRNA序列，能將Cas9酶切蛋白引導至目的基因特定位點使之DNA 雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSB）。非同源性末端接合（Non-homologous end joining，NHEJ）參與修復DSB，產生突變等位基因。CRISPR/Cas9系統可實現基因敲入、重排、激活、抑制、重組和敲除，具有高效、專一和成熟等優點。故該研究采用CRISPR/Cas9敲除小鼠體內的UOX基因，以構建高尿酸血動物模型。

UOX作為目的基因的考量在于，UOX基因能表達活化態UOX蛋白，使小鼠體內尿酸在UOX催化下分解為尿囊素，最終形成尿囊酸排泄。若成功基因敲除小鼠UOX基因，有望使尿酸潴留形成高尿酸模型[12]。人體內UOX基因在進化過程中突變沉默，尿酸無法繼續分解，成為嘌呤核苷酸代謝終末產物直接排泄[13]。故采用基因敲除小鼠UOX基因的方式改造高尿酸模型，與直接注入誘導劑至動物體內構建的高尿酸模型相比，更真實復制人嘌呤代謝紊亂引起的高尿酸血癥及痛風機制。

該研究在小鼠UOX基因第三個外顯子功能域上設計拼接了sgRNA。注射受精卵是獲得CRISPR/Cas9改造動物模型最快的途徑[14]，故該研究將體外轉錄后的sgRNA和Cas注射到原核胚中。基因編輯后的原核胚體外培養為二細胞胚，再通過手術將胚移植到代孕母鼠的子宮內孕育。3周后，17只F0代小鼠出生，經提取DNA擴增后電泳分析和測序分析，其中8只小鼠確定為UOX-突變小鼠，突變率為47.06%，其中一只小鼠為疑似突變。并且，該研究成功繁育成功建立了UOX-突變小鼠純合種群，形成了穩定的UOX敲除小鼠模型。突變小鼠與正常小鼠外觀和精神狀態一致，無感染或外傷發生。Hosoyamada M等人[12] 雙敲除小鼠Urat1-Uox基因構建腎性低血糖癥動物模型，發現Urat1-Uox-DKO小鼠中尿酸鹽的尿排泄量比人類高約25倍，印證了該文敲除小鼠UOX基因可用于構建高尿酸模型。

綜上所述，該研究首次采用敲除小鼠UOX基因構建高尿酸模型，能獲得穩定、健康的UOX敲除小鼠品系，為高尿酸動物模型的建立提供了新的思路及方法。該研究進一步挖掘UOX基因的作用及改造方法，為其科研或臨床應用提供依據。

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（收稿日期：2019-12-05）