不孕癥患者子宮內膜息肉ER、PR、Ki-67 及β-catenin 的表達及病因探討

莫曉榮，王娟，張賓，任菲，黎曉虹，李玲秋，徐春蘭，甘艷屏

(廣西壯族自治區生殖醫院，廣西 南寧)

0 引言

子宮內膜息肉(Endometrial Polyps EP)是由腺體、間質、厚壁血管組成的突出于宮腔內的良性病變，有文獻報道其發病率為24%～25%[1]，但部分患者也可出現惡性腫瘤，絕經后息肉惡變的患病率是5.42%，生育年齡息肉惡變的患病率是1.51%[2]。現在不孕癥患者越來越多，子宮內膜息肉是子宮性因素中的重要原因之一，而子宮內膜息肉的病因學和發病機制仍不明確。本研究選取2018 年1 月至2019 年6 月的136 例不孕癥患者的臨床資料進行分析，進一步探討EP 的病因學和發病機制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取2018 年1 月至2019 年6 月就診于廣西壯族自治區生殖醫院婦科的136 例不孕癥患者，于月經干凈后2-5 天宮腔鏡下切除息肉或子宮內膜活檢，其中宮腔鏡檢查且病理診斷為子宮內膜息肉有76 例，正常子宮內膜息肉有60 例(病理檢查為增殖期子宮內膜)。

病例取材前3 個月均無接受過任何激素治療及放置宮內節育器，無生殖道炎癥及婦科腫瘤等病史。本研究遵循的程序符合本院人體試驗委員會所制定的倫理學標準，得到該委員會批準，并征得受試對象本人的知情同意，并與之簽署臨床研究知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑和主要儀器

ER 抗 體(abcam 公 司，ab32063)，PR 抗 體(abcam 公 司，ab2765)，PTEN 重組抗體(abcam 公司，ab170941)，β-catenin 抗體(abcam 公司，ab194118)，驢抗兔IgG H&L (HRP)(abcam 公司，ab6802)，通用二步法試劑盒(小鼠/兔增強聚合物法檢測系統，PV-9000)(中杉金橋公司)，DAB 染色試劑盒20X(中杉金橋公司)，電壓力鍋(美的公司)，熒光顯微鏡(BX53)(日本Olympus 公司)，Leica Leitz 1512 Rotary Microtome 切片機(Leica 公司)

1.2.2 ER、PR 及Ki-67 檢測均采用免疫組化進行，常規石蠟切片脫蠟、梯度酒精進水，使用檸檬酸鹽高壓修復(10min)，內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育(10min)，PBS 沖洗，反應增強液室溫孵育(20min)，PBS 沖洗(3×3min)，滴加增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物室溫孵育1.5h，PBS 沖洗(3×3min)，DAB 染色(4min)，PBS 沖洗(3×3min)，蘇木素復染數秒，蒸餾水沖洗(3×1min)。酒精升濃度脫水(5×5min)，二甲苯透明(2min)，樹脂封片。使用中杉金橋PV-9000 試劑盒并嚴格按照說明書進行操作。

1.2.3 β-catenin 的檢測采用熒光免疫實驗，常規石蠟切片脫蠟、梯度酒精進水，使用檸檬酸鹽高壓修復5min 后放置冷卻至室溫。PBS 沖洗，PBS-GT 浸泡4×12min，加入β-catenin 抗體，然后置于37℃中孵育2h。PBS 清洗，使用熒光增強劑封片。

1.3 觀察指標及評價標準

1.3.1 ER、PR 及Ki-67 結果判定

①細胞核內含棕黃色顆粒者為受體陽性細胞，按百分比計分，0 分：陽性細胞＜5%；1 分：陽性細胞5%～25%；2 分：陽性細胞26%～50%；3 分：陽性細胞51%～75%；4 分：陽性細胞＞75%。②細胞質按染色強度計分，1 分：染色呈淡黃色；2 分：染色呈黃色；3 分：染色呈棕黃色。③將二者計分相乘即得出陽性強度，(-)：0 分；(+)：1～4 分；(++)：5～8 分；(+++)：9～12 分。

1.3.2 β-catenin 結果判定

計數500 個腺體細胞，細胞核或者細胞膜含綠色熒光標記者為陽性細胞，按百分比計分，0 分：陽性細胞＜5%；1 分：陽性細胞5%～25%；2 分：陽性細胞26%～50%；3 分：陽性細胞51%～75%；4 分：陽性細胞＞75%。陽性強度(-)：0 分；(+)：1 分；(++)：2 分；(+++)：3 分。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計學軟件處理數據，計數資料以率(%)表示，各組之間陽性率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 136 例患者年齡為22-40 歲，其中對照組年齡為(32.45±4.967)歲，觀察組年齡(33.44±6.405)歲(P＞0.05)，兩組年齡差異無統計學意義。對照組月經周期為(27.45±3.95)天，觀察組月經周期為(28.32±3.205)天(P＞0.05)，兩組月經周期差異無統計學意義。

2.2 觀察組及對照組的ER、PR、Ki-67 及β-catenin 表達陽性率比較

觀察組患者的ER 表達陽性率明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。PR、Ki-67 及β-catenin 的表達陽性率均低于對照組，差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組的ER、PR、Ki-67 及β-catenin 陽性表達比較[例(%)]

3 討論

子宮內膜息肉是婦科常見病，可發生在青春期后的任何年齡，其中較多發生在育齡期及圍絕經婦女，可無臨床癥狀，有時通過B 超檢查發現，或臨床表現為經量多，經期延長及不孕等癥狀，因其缺乏特異性的臨床表現，容易漏診及誤診[3]。目前，引起子宮內膜息肉的病因及發病機制還不明確，有觀點認為[4]與炎癥刺激有關，認為在整個月經周期中，EP 激活的肥大細胞數目比正常子宮內膜的高7 倍多，比如反復宮腔操作、流產術及放置宮內節育器等。

有些學者認為可能與細胞增殖、凋亡失衡相關，Ki-67 是一種與細胞有絲分裂相關的核抗原，可以反映細胞的增殖活性，其表達增強是細胞增殖活性增加的可靠標記。Ki-67 幾乎在全身各部位腫瘤的增殖細胞中均有表達，認為Ki-67 的高表達對子宮內膜息肉的發生可能具有預測作用[5]。而Risberg 等[6]研究發現，在未絕經婦女的子宮內膜息肉中Ki-67 呈現低表達。本研究中Ki-67在觀察組與對照組中差異無統計學意義，可能與本研究中的樣本量少有關，可在之后的研究中擴大樣本量再進一步探討。

現在多數學者認為與激素刺激學說相關，認為EP 為激素依賴性疾病，雌激素可促進細胞分裂，促使子宮內膜增生，孕激素可對抗這種作用，誘導子宮內膜向分泌期轉化，發生周期性撤退剝脫，高雌激素、低孕激素狀態可導致子宮內膜過度增殖，促使子宮內膜息肉的發生[4]。研究同樣表明，子宮內膜息肉的形成以子宮內膜局部ER、PR 失衡為主，使子宮內膜對雌激素、孕激素反應不一致，ER 表達較高的子宮內膜可在雌激素的刺激下過度增生，PR 的低表達使孕激素抑制ER 生成的作用減弱，導致ER 持續高水平表達，局部組織接受了雌激素的持續刺激而呈現顯著增殖狀態，組織過度增生最終形成子宮內膜息肉[7]。本研究也表明ER 在子宮內膜的局部組織中表達并不一致，ER 在觀察組的表達明顯高于對照組，而PR 在觀察組與對照組的表達中差異無統計學意義，提示ER 在息肉組織中的高表達對雌激素敏感，可認為局部組織相對接受了雌激素的持續刺激 ，導致子宮內膜過度增生形成子宮內膜息肉，與夏蘭恩等[8]提出的觀點基本一致。本文研究病例均為卵泡期子宮內膜，可能導致研究結果有一定的局限性。

2003 年KIM 等[9]提出子宮內膜異位癥(EMT)與EP 具有相關性，發現EMT 合并有EP 的發病率高達47.6%～68.4%，而在EMT 相關不孕癥中EP 的發病率更是明顯升高。本研究子宮內膜異位癥不孕癥患者中合并EP 的發生率為46.1%，非子宮內膜異位癥不孕癥患者中合并EP 的發生率為21.7%(P＜0.05)。有學者提出EMT 與EP 都表現為雌激素依賴性增生過長，均能導致不孕，認為兩者可能存在相同的生理病理基礎，需進一步研究兩者的發病機制，有助于提高其臨床診治率，同時也可進一步提高不孕癥的治愈率[10]。

β-catenin 是一種多功能蛋白，游離型β-catenin 通過核膜進入到細胞核內，與DNA 親和蛋合，激活Wnt 途徑靶基因調節細胞增生，參與腫瘤形成，隨著子宮內膜病變的進展，細胞膜中β-catenin 蛋白表達減少，而細胞核中β-catenin 蛋白表達增加[11]。有研究提出β-catenin 蛋白在卵巢子宮內膜異位囊腫囊壁組織中高表達，雌激素 (E2) 上調β-catenin 表達激活Wnt/β-catenin 信號，可能參與子宮內膜異位癥(EMT)的發病[12]，而EMT 與EP 有臨床相關性，可對三者的相關性進一步研究。在本研究中，β-catenin在兩組陽性表達率差異無統計學意義，尚不能認為β-catenin 的異常表達參與子宮內膜息肉的形成。但有學者[13]提示β-catenin 可能與子宮內膜腺癌的發生及進展有關，推測β-catenin 可作為鑒別子宮內膜息肉和子宮內膜腺癌疾病的標志物。

子宮內膜細胞的增殖活躍、凋亡減低、血管形成能力與子宮內膜息肉形成相關，如P63 蛋白高表達、凋亡抑制蛋白Bcl-2 的表達、血管內皮生長因子(VEGF)的高表達和微血管密度(MVD)的增加等[11]。近期，有學者提出子宮內膜息肉的形成與金屬的氧化應激相關，如銅/鋅比值，但是與血清中金屬雌激素(金屬離子與雌激素受體結合形成)水平的升高無關，目前還沒有相關研究提出這些金屬雌激素的水平[14]。

筆者認為局部子宮內膜的ER 異常表達參與了子宮內膜息肉的發生發展，此外，子宮內膜息肉的形成可能與細胞增殖、細胞凋亡相關，可能受到其他金屬的氧化應激、細胞因子等的調控，因此還需要更多的研究。