三七皂苷R1抑制TGF-β1/Smad3信號傳導對糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化和炎癥細胞因子的調節作用研究①

高利超 徐 兵 劉永安 陳建勇 李 佳 張 巖

(西南醫科大學附屬醫院腎病內科，瀘州 646000)

糖尿病是世界性健康問題，具有高發病率和高死亡率，可分為1型和2型糖尿病，常伴有心血管和腎衰竭等病變，約30%的1型糖尿病可發展為終末期腎病[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)在臨床上以進行性蛋白尿、高血壓和腎臟功能丟失導致的水腫和尿毒癥為特點；在組織學上，以基底膜增厚，細胞外基質(extracellular matrix,ECM)累積和細胞增生引起的系膜擴張及最終導致的間質纖維化和腎小球硬化為主要特征；DN的發病機制復雜，氧化應激、高血糖、轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)等生長因子活化、糖基化終產物的產生和多種信號通路的激活在腎臟損傷的發病機制中起重要作用[2,3]。研究表明，TGF-β1是已知最重要的致纖維化因子，抑制TGF-β1/Smad3信號通路對糖尿病腎病大鼠具有保護作用[4]。三七皂甙R1(Notoginsenoside R1,NGR1)是傳統中藥三七的特征性成分，具有包括抗細胞凋亡、自噬激活、抗炎、抑制缺血再灌注損傷、清除氧自由基等在內的多種生物學活性[5-9]。目前，關于NGR1對糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化、炎癥反應及與TGF-β1/Smad3信號通路的相關性研究尚無報道。本文采用高脂飼喂聯合腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)的方法建立DN模型，研究NGR1對模型大鼠腎臟纖維化、炎癥反應的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠，體質量(211.2±10.5)g，購自北京維通利華公司[許可證號為SCXK (京) 2014-0001，合格證號：0015675]。飼養溫度18～26℃，濕度40%～70%，自由采食和飲水。

1.1.2主要試劑與儀器 NGR1標準品(貨號：N3915，純度≥98%)、STZ(貨號：V900890)購自上海Sigma公司；血清肌酐、尿素氮試劑盒購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；HE試劑盒購自北京博奧森公司；尿蛋白、ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗體購自北京Abcam公司。雅培安妥血糖儀及試紙購自美國雅培公司；酶標儀、-80℃冰箱購自美國Thermo公司；PCR儀、電泳儀及半干轉膜儀購自美國伯樂公司；Gel View 6000化學發光凝膠成像系統購自廣州云星儀器有限公司；日本奧林巴斯 BX43-32PO1顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1模型建立與分組 大鼠適應性飼養7 d，高脂飼喂4周聯合單次腹腔注射65 mg/kg STZ建立DN模型[10]，于STZ注射72 h后，檢測大鼠空腹血糖，選擇超過200 mg/dl的大鼠進行后續實驗。當天，取上述空腹血糖值達標的大鼠，按血糖值將大鼠隨機分為6組：對照組(Control組)、模型組(DN組)、NGR1低中高劑量組[DN+ NGR1 (5 mg)、DN+ NGR1 (10 mg)、DN+ NGR1 (20 mg)]和陽性對照組(DN+MET)。NGR1低中高劑量組灌胃給予對應劑量的NGR1溶液，陽性對照組給予500 mg/kg的MET溶液，對照組和模型組給予等量的生理鹽水。每天給藥1次，連續8周。

1.2.2樣本采集 給藥結束當日晚大鼠禁食，安放代謝籠留取24 h尿液；次日稱重空腹大鼠體質量，麻醉后行腹主動脈采血；斷頭處死大鼠后，摘取大鼠腎臟并稱重。

1.2.3檢測腎臟指數和尿蛋白、血清肌酐和尿素氮的檢測 腎臟指數(mg/g)=雙腎重量/大鼠體質量；如1.2.2所述收集尿液2 000 r/min離心10 min，取上清檢測尿蛋白含量；取1.2.2所述血液5 ml，于4℃條件下放置30 min，1 500 r/min離心10 min，取上清檢測血清肌酐和尿素氮含量。

1.2.4腎組織病理學觀察 取1.2.2中，各組大鼠腎組織經過10%福爾馬林固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋后，切成4 μm片，脫蠟后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色，脫水，透明，固定。在光學顯微鏡下觀察腎臟組織中腎小球和腎小管的病理學改變。

1.2.5血清炎癥細胞因子含量檢測 取1.2.2所述血液，4℃條件下3 000 r/min離心10 min，收集上清，嚴格按照試劑盒操作，檢測炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的含量。

1.2.6免疫組織化學檢測α-SMA在腎臟中的表達情況 制作各組大鼠腎臟組織切片，經二甲苯脫蠟30 min ×2次；酒精梯度脫水(100%酒精5 min ×2；95%、85%、75%酒精各5 min)；蒸餾水漂洗1 min；3%H2O237℃下作用10 min，抑制內源性過氧化物酶活性；用0.01% PBS沖洗5 min×3；在37℃下用蛋白酶消化30 min，用0.01% PBS沖洗5 min ×3；在37℃下用5%山羊血清孵育1.5 h。α-SMA免疫組織化學陽性判斷方法：細胞核有棕色顆粒沉著。

1.2.7RT-PCR檢測TGF-β1/Smad3信號通路表達水平 根據說明書，用Trizol試劑提取腎臟總RNA，并用PrimeScript試劑盒進行反轉錄，以β-actin為內參。β-actin引物：5′-AGG CCA ACC GTG AAA AGA TG和ACC AGA GGC ATA CAG GGA CAA-3′；TGF-β1引物：5′-GAC TCC TGC TGC TTT CTC C和GCG GTC CAC CAT TAG CAC-3′；Smad3引物：5′-GTC AAC AAG TGG TGG CGT GTG和GCA GCA AAG GCT TCT GGG ATA A-3′。

1.2.8Western blot檢測纖維化相關蛋白和TGF-β1/Smad3信號通路表達水平 冰上用含蛋白酶抑制劑的裂解液裂解各組大鼠腎組織，提取總蛋白，4℃離心收集，取上清，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度。100℃變性10 min，每組取等量蛋白質進行SDS-PAGE凝膠電泳轉移蛋白質到PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉蛋白質2 h，加入一抗(1∶500)于4℃孵育過夜。棄去一抗，再加入辣根過氧化物酶標記的對應二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。滴加ECL發光液于暗室曝光顯影，以GAPDH為內參。根據條帶灰度值計算相對蛋白表達。

2 結果

2.1NGR1對DN大鼠一般情況的影響 對照組大鼠精神狀態良好，活潑好動；模型組大鼠隨著實驗的進行，出現多飲、多尿、多食和體質量下降的“三多一少”糖尿病典型特征，且精神狀態、皮毛光澤和運動靈敏性也欠佳；而各治療組大鼠上述指標均較模型組有不同程度改善。

2.2NGR1對DN大鼠腎臟功能的影響 各組大鼠腎臟指數、尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平結果如圖1 所示：與對照組相比，模型組大鼠腎臟指數、蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平均有顯著統計學意義(P<0.01)，證明DN大鼠模型造模成功；與模型組相比，NGR1劑量組和陽性對照組大鼠上述指標均有不同程度的下降，NGR1低劑量組無統計學意義(P>0.05)，NGR1中、高劑量組和陽性對照組大鼠上述指標存在統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

2.3NGR1對DN大鼠腎臟病理學改變的影響 對各組大鼠腎組織切片進行HE染色，結果如圖2所示，鏡下可見對照組大鼠腎組織腎小球結構基本正常，未見系膜細胞增生，細胞胞漿豐富，排列緊密；模型組大鼠腎組織可見腎小球肥大，系膜基質增多，腎小管腫脹、空泡變性和炎癥浸潤等病理學改變；NGR1低劑量組病理學改變與模型組相似，但NGR1中高劑量組和陽性對照組可見明顯的病理學改變。

2.4NGR1對DN大鼠炎癥細胞因子表達水平的影響 ELISA檢測各組大鼠炎癥細胞因子含量水平，結果如圖3所示：與對照組相比，模型組大鼠高表達TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ(P<0.01)，各NGR1治療組大鼠上述炎癥細胞因子表達均有不同程度的降低，而NGR1低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)，NGR1中、高劑量組和陽性對照組上述指標存在統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

2.5NGR1對DN大鼠腎臟纖維化相關蛋白表達水平的影響 Western blot檢測各組大鼠腎臟纖維化相關蛋白表達水平，結果如圖4A所示：與對照組相比，模型組大鼠高表達CollagenⅣ、FN和TIMP-1蛋白，低表達MMP-9蛋白(P<0.01)，各NGR1治療組大鼠上述纖維化指標蛋白表達均有不同程度的逆向改變，而NGR1低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)，NGR1中、高劑量組和陽性對照組上述指標存在統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

圖1 NGR1對DN大鼠腎臟功能的影響Fig.1 Effects of NGR1 on renal function in DN ratsNote: Compared with the control group，**.P<0.01;compared with DN group，#.P<0.05，##.P<0.01.

圖2 NGR1對DN大鼠腎臟病理學改變影響(×400)Fig.2 Effects of NGR1 on renal pathological changes in DN rats(×400)

圖3 NGR1對DN大鼠炎癥細胞因子表達水平的影響Fig.3 Effects of NGR1 on expression of inflammatory cytokines in DN ratsNote: Compared with the control group，**.P<0.01;compared with DN group，#.P<0.05，##.P<0.01.

圖4 NGR1對DN大鼠腎臟纖維化相關蛋白表達水平的影響(×400)Fig.4 Effects of NGR1 on expression of fibrosis-related proteins in kidneys of DN rats(×400)Note: A.Protein expression level of Collagen Ⅳ,FN,MMP-9 and TIMP-1 detected by Western blot;B.Expression level of α-SMA detected by immunohistochemical.Compared with the control group，**.P<0.01;compared with DN group，#.P<0.05；##.P<0.01.

圖5 NGR1對DN大鼠TGF-β1/Smad3信號通路表達的影響Fig.5 Effects of NGR1 on expression of TGF-β1/Smad3 signaling pathway in DN ratsNote: A.Expression level of TGF-β1 and Smad3 detected by RT-PCR;B.Protein expression level of TGF-β1 and Smad3 detected by Western blot.Compared with the control group，**.P<0.01；compared with DN group，#.P<0.05,##.P<0.01.

免疫組織化學實驗檢測各組大鼠腎臟纖維化標記蛋白α-SMA表達水平，結果如圖4B所示：對照組大鼠腎臟組織基本未見α-SMA表達，而模型組大鼠可見腎小管上皮細胞內有大量α-SMA表達，NGR1低劑量組大鼠腎臟內α-SMA表達水平與模型組程度相當，NGR1中高劑量組和陽性對照組大鼠腎臟內α-SMA表達水平較模型組大鼠明顯降低。

2.6NGR1對DN大鼠TGF-β1/Smad3信號通路表達的影響 RT-PCR檢測各組大鼠TGF-β1/Smad3信號通路表達情況，結果如圖5A所示：與對照組相比，模型組大鼠TGF-β1和Smad3的mRNA表達水平均顯著增加(P<0.01)，NGR1中高劑量組和陽性對照組TGF-β1和Smad3的mRNA表達水平較模型組均差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。Western blot各組大鼠TGF-β1/Smad3信號通路表達情況，結果如圖5B所示：與對照組相比，模型組大鼠TGF-β1和Smad3蛋白表達水平均顯著增加(P<0.01)，NGR1中高劑量組和陽性對照組TGF-β1和Smad3蛋白表達水平較模型組差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

3 討論

DN是一種嚴重的糖尿病微血管并發癥，發病不易被察覺，出現臨床癥狀時往往已發展成嚴重的終末腎衰竭；DN前期主要病理變化表現為腎小球過濾增加，并伴隨腎小球硬化、腎小管間質纖維化及系膜增生等病理改變；臨床以持續的蛋白尿和腎功能進行性下降為主要表現[11]。本文通過連續飼喂高脂飼料4周后，單次大劑量腹腔注射STZ的方法建立DN大鼠模型，之后給予NGR1連續治療8周。結果發現：模型組大鼠表現出典型的“三多一少”癥狀、腎臟肥大指數和腎臟功能評價常用指標(尿蛋白、血清肌酸酐和尿素氮)明顯上升，符合DN發展進程表現，證明本文成功復制DN大鼠模型；NGR1中高劑量組(10、20 mg/kg)和陽性對照組(MET,500 mg/kg)大鼠上述指標較模型組大鼠均有明顯的降低，且差異存在統計學意義，提示 20 mg/kg的NGR1可有效改善DN大鼠的腎臟功能。對大鼠腎臟組織進行HE染色也進一步證明建模方法的可靠性及NGR1治療對DN大鼠腎臟微結構損傷的改善作用。綜合實驗結果，20 mg/kg的NGR1治療能有效改善DN大鼠腎臟功能及微結構病理損傷。

近年來的研究表明，炎癥在包括DN在內的多種疾病中發揮著重要作用，通過破壞促炎-抗炎動態平衡可推進疾病進程[12，13]。研究表明，NGR1通過抑制炎癥反應和腎臟足細胞凋亡，有效改善了DN大鼠的腎臟缺血再灌注損傷[8,9]。本文研究發現，NGR1中高劑量組(10、20 mg/kg)大鼠炎癥細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ)血清水平明顯下調。證明足夠劑量的NGR1治療能通過降低炎癥細胞因子表達，減輕炎癥損傷，進而維持腎臟基本的微結構完整性，實現對DN大鼠腎臟功能和病理損傷的改善作用。Lin等[14]研究也發現，DN大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IFN-γ含量均明顯升高，與本研究結果相似。

腎臟纖維化是導致終末腎病的主要病理學基礎，同時也是多種病因導致的慢性腎臟疾病進行性發展的共同通路，TGF-β1是重要的致纖維化因子，在腎臟組織中通常由腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞分泌，而Smads蛋白是目前認為的TGF-β1受體唯一的激酶底物，介導其下游胞內信號傳導，從而誘導腎臟細胞肥大、增加ECM沉積、促進腎小球基底膜增厚等，并促進腎小球硬化和腎小管間質纖維化的發生[15-17]。本研究發現，在DN模型大鼠腎臟組織中，纖維化和ECM相關蛋白(CollagenⅣ、FN、MMP-9和TIMP-1)的表達水平均受到NGR1的有效調節，證明NGR1治療能有效降低DN大鼠腎臟組織ECM沉積和纖維化發生。α-SMA在腎小管上皮細胞中的表達程度與腎小管纖維化程度呈正相關，被認為是評估腎小管上皮細胞轉化及間質纖維化的重要指標；在糖尿病小鼠中，抑制TGF-β1、CollagenⅣ和FN表達，可預防腎小球硬化和間質纖維化發生；另外，MMPs能促進ECM降解，其中MMP-9與腎臟纖維化關系密切，基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)則可抑制MMPs活性，以維持ECM沉積和降解之間的平衡[18-20]。為進一步證明NGR1抑制ECM沉積和纖維化作用與TGF-β1/Smad3信號通路活化的相關性，檢測TGF-β1、Smad3的mRNA和蛋白表達水平發現：NGR1治療DN大鼠后，該通路在mRNA和蛋白水平的表達均受到抑制。綜合實驗結果，NGR1對DN大鼠的腎臟損傷保護作用可能與抑制TGF-β1/Smad3信號通路活化相關，但是否還有其他信號通路的參與有待進一步研究。

綜上所述，本文發現NGR1能降低糖尿病腎病模型大鼠的腎臟肥大指數和腎臟功能損傷指標，改善腎臟微結構改變，抑制炎癥細胞因子表達，調節ECM相關基因及信號通路表達水平，從而起到對DN大鼠的腎臟保護作用。本文旨在為DN的治療提供參考。