大黃素對大鼠局灶性腦缺血的保護作用及其機制

畢勇志，馬 芬，時俊霞，宋琳琳，李林澤

(1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，河南 開封 475000；2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，河南 開封 475000)

急性缺血性腦卒中是由于腦動脈閉塞引起缺血和缺氧導(dǎo)致的腦組織壞死軟化的疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的特點[1]。急性缺血性腦卒中的發(fā)病機制至今尚未完全明確，有研究[2]表明：其發(fā)生通常伴隨著神經(jīng)元炎癥反應(yīng)。核轉(zhuǎn)錄因子 κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要通路，研究[3-4]顯示：NF-κB p65可以直接誘導(dǎo)各種炎癥因子的表達。

大黃素是中藥大黃的主要有效成分，可通過血腦屏障，短期內(nèi)給予大鼠大劑量服用無明顯毒性[5]。藥理研究[6-7]表明：大黃素具有抗炎作用和神經(jīng)保護作用。大黃素可與葡萄糖結(jié)合為蘆薈大黃素-8-0-葡萄糖苷，降低活性氧生成和NF-κB活性，抑制炎性因子的分泌[8]。目前關(guān)于大黃素對大鼠腦缺血的保護作用尚未明確，本研究采用大腦中動脈阻斷法(middle cerebral artery occlusion, MCAO)建立局灶性腦缺血大鼠模型，探討大黃素對局灶性腦缺血的保護作用及其對NF-κB信號通路的影響，為研究大黃素對大鼠局灶性腦缺血的保護作用及其機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器60只SPF級SD 大鼠，雌性，6月齡，體質(zhì)量為(220±20)g，購自河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物使用許可證號：SCXK(豫)2016-0006。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實驗室溫度為(22±3)℃，濕度為(55±5)%。大黃素購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(純度>98%，批號：20180301)。白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細胞介素 1β(interleukin-1β, IL-1β) ELISA試劑盒購自美國R&D公司，兔抗人NF-κB購自上海捷瑞生物工程有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因兔多克隆抗體購自生工生物工程(上海)股份有限公司。MicroTec旋轉(zhuǎn)式切片機(德國甘特工具和機械制造有限公司)，AMR-100酶標分析儀(成都昱強科技有限公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗動物分組將60只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，陽性對照組，低、中和高劑量大黃素組，每組10只。假手術(shù)組和模型組大鼠分別給予生理鹽水；陽性對照組大鼠給予地塞米松[9](5 mg·kg-1)；低、中和高劑量大黃素組大鼠給藥劑量按照人與動物體表面積等效劑量計算，按照中國藥典規(guī)定成人日用量乘以6.3倍，分別灌胃給予10、20和40 mg·kg-1大黃素。各組大鼠造模前3 d開始給藥，每天灌胃1次，連續(xù)給藥3 d后建立MCAO動物模型。

1.3 MCAO動物模型的建立[10]大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量為350 mg·kg-1，酒精消毒后，沿頸部中線偏左側(cè)剖開皮膚，鈍性分離肌肉，結(jié)扎頸外動脈遠端處，結(jié)扎近心端，結(jié)扎頸總動脈遠心端，用動脈夾將頸內(nèi)動脈夾閉，頸外動脈遠端結(jié)扎處剪斷1個“V”型小口，將3.0 mm尼龍絲線插入動脈，沿小口徹底剪斷頸外動脈。將頸外動脈殘端沿著頸內(nèi)動脈拉直，緩慢推進絲線，感到阻力時停止，離頸總動脈分叉2 cm處結(jié)扎備線。阻塞動脈90 min，緩慢輕柔拉出絲線，再灌注48 h。假手術(shù)組大鼠僅進行動脈分離，但不插入絲線。待大鼠蘇醒后評估神經(jīng)功能缺損，大鼠不能伸展右側(cè)前肢、行走時向右轉(zhuǎn)圈或行走時向右側(cè)傾倒視為模型制備成功[11]。

1.4 各組大鼠行為學(xué)評分各組大鼠于造模后24 h提尾懸空離地面約40 cm，觀察兩前肢狀態(tài)；將大鼠置于水平地面，輕按雙肩，觀察兩側(cè)抵抗力；將大鼠置于地面，觀察其行走情況。按照BEDERSON等[12]的方法評分：行為完全正常，0分；提尾懸空時，大鼠手術(shù)對側(cè)前肢表現(xiàn)腕肘屈曲、肩內(nèi)旋、肘外展、緊貼胸壁，計1分；大鼠置于地面，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動時阻力降低，計2分；將大鼠放置在地面上，圍繞手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈計3分；無法自主活動，計4分。分數(shù)越高說明大鼠神經(jīng)行為損傷越嚴重。

1.5 TTC染色檢測各組大鼠腦梗死體積大鼠頸總動脈取血后，斷頭取腦，沿冠狀切成5片，厚度為2 mm，將腦組織切片置于2%TTC染液中37℃避光處理30 min，染色后，玫瑰紅色為正常組織，白色為缺血組織。采用計算機Image-Pro Plus軟件測量腦梗死面積和切片厚度，計算腦梗死體積，腦梗死體積=梗死區(qū)面積/切片厚度，所有切片腦梗死體積之和為腦梗死總體積，計算腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比=腦梗死總體積/大鼠腦組織總體積。

1.6 ELISA法檢測各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中 IL-6、IL-1β和TNF-α水平取各組大鼠腦組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干，分離缺血側(cè)海馬組織，置于玻璃勻漿器，加適量生理鹽水配成腦組織勻漿，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，檢測各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，所有步驟嚴格按照試劑盒使用說明書操作。

1.7 Western blotting法檢測各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65和核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白α(nuclear transcription factor-κB inhibitor-α,IκBα)表達水平采用RIPA裂解液對各組大鼠缺血側(cè)海馬組織進行裂解，12 000 r·min-1提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，繪制標準曲線計算上樣量，取30 μg蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉稀釋的NF-κB p65和IκBα抗體置于4℃封閉過夜，5% 脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，以GAPDH作為內(nèi)參，計算各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65和IκBα蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評分假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，其余各組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，但程度不同。與模型組比較，陽性對照組，中和高劑量大黃素組大鼠行為學(xué)評分明顯降低(P<0.05)。與低劑量大黃素組比較，陽性對照組和中及高劑量大黃素組大鼠行為學(xué)評分明顯降低(P<0.05)。中和高劑量大黃素組大鼠行為學(xué)評分與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)評分

GroupBehavioral scoreSham operation0Model2.90±0.74Positive control1.60±0.70*△Emodin Low dose2.70±0.67 Medium dose 1.90±0.74*△ High dose1.80±0.79*△

*P<0.05vsmodel group；△P<0.05vslow dose of emodin group.

2.2 各組大鼠腦梗死體積百分比假手術(shù)組大鼠腦組織無梗死，其余各組大鼠腦組織均出現(xiàn)不同程度壞死。與模型組比較，陽性對照組和低、中及高劑量大黃素組大鼠腦梗死體積百分比均明顯降低(P<0.05)。與低劑量大黃素組比較，陽性對照組，中和高劑量大黃素組大鼠腦梗死體積百分比明顯降低(P<0.05)。中和高劑量大黃素組大鼠腦梗死體積百分比與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖1(插頁八)。

2.3 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和低、中及高大黃素劑量組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低(P<0.05)。與低劑量大黃素組比較，陽性對照組和中及高劑量大黃素組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低(P<0.05)。中和高劑量大黃素組大鼠缺血側(cè)海馬組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組大鼠腦梗死體積百分比

GroupPercentage of cerebral infarction volume Sham operation0Model23.40±1.94Positive control11.56±1.39*△Emodin Low dose15.45±1.38* Medium dose13.03±1.44*△ High dose11.82±1.99*△

*P<0.05vsmodel group；△P<0.05vslow dose of emodin group.

表3 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平

GroupIL-6IL-1βTNF-αSham operation1.045±0.2451.562±0.3540.458±0.084Model2.872.±0.354*2.645±0.403*1.256±0.256*Positive control1.135±0.175△#1.306±0.312△#0.521±0.102△#Emodin Low dose1.548±0.206△1.635±0.250△0.727±0.093△# Medium dose1.280±0.213△#1.458±0.231△#0.593±0.071△# High dose1.254±0.134△#1.425±0.176△#0.584±0.086△#

*P<0.05vssham operation group；△P<0.05vsmodel group；#P<0.05vslow dose of emodin group.

2.4 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65和IκBα蛋白表達水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，IκBα蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和低、中及高劑量大黃素組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，IκBα蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。與陽性對照組比較，低、中和高劑量大黃素組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，IκBα蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。與低劑量大黃素組比較，中和高劑量大黃素組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，IκBα蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見表4和圖2。

表4 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB表達水平

GroupNF-κB p65IκBα proteinSham operation0.753±0.0320.653±0.021Model1.310±0.025*0.165±0.023*Positive control0.944±0.024△ 0.473±0.031△Emodin Low dose1.215±0.027△#0.307±0.033△# Medium dose1.136±0.020△#○0.394±0.040△#○ High dose1.082±0.025△#○0.420±0.035△#○

*P<0.05vssham operation group；△P<0.05vsmodel group；#P<0.05vspositive control group;○P<0.05vslow dose of emodin group.

Lane 1: Sham operation group；Lane 2:Model group；Lane 3:Positive control group；Lane 4-6:Low, medium, and high doses of emodin groups.

圖2 Western blotting法檢測各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65和IκBα蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of NF-κB p65 and IκBα proteins in hippocampus tissue at ischemic side of rats in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

急性缺血性腦卒中的病理生理過程復(fù)雜，其發(fā)生機制包括自由基損傷、興奮性氨基酸產(chǎn)生、鈣超載和炎癥反應(yīng)等一系列過程[13]。其中促炎性因子主要由激活的小膠質(zhì)細胞和星型膠質(zhì)細胞分泌，可加劇神經(jīng)元損傷[14]。因此抑制炎癥反應(yīng)是治療腦缺血的重要策略。本研究采用MCAO法制備局灶性腦缺血大鼠模型，觀察大黃素對模型大鼠腦缺血的保護作用，探討其神經(jīng)保護作用的可能機制。

IL-1β是由神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞合成及分泌的細胞因子，主要分布于腦組織，協(xié)同其他細胞因子促進活化B細胞和T細胞，還能通過誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)產(chǎn)生加強內(nèi)皮細胞與白細胞黏附[15]。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細胞因子，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)時，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌功能、介質(zhì)釋放和抗原遞呈等過程。除此之外，IL-1β和TNF-α還可以通過激活細胞分泌細胞炎性因子，如誘導(dǎo)IL-6的合成。IL-6由單核細胞、成纖維細胞、T細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，參與機體炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)過程，是急性缺血期腦損傷程度的重要標志之一[16]。IL-1β、TNF-α和IL-6對急性缺血性腦卒中的發(fā)生起重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死體積百分比均明顯增加，缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高，給予低、中和高劑量大黃素和地塞米松干預(yù)均能減輕腦梗死體積，降低大鼠腦組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，提示腦缺血引起海馬組織損傷會引起炎性因子水平升高，與王喜豐等[18]研究結(jié)果一致，同時說明給予不同劑量大黃素能夠通過抑制炎性因子的分泌，對局灶性腦缺血起保護作用。

NF-κB是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)多種細胞炎性因子的表達，造成組織損傷。NF-κB以p65異二聚體形式與其抑制性蛋白IκBα結(jié)合，表現(xiàn)為非活化狀態(tài)。NF-κB能夠促進IL-1β和TNF-α炎性細胞因子表達，同時，IL-1β和TNF-α進一步活化NF-κB蛋白，促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高，IκBα蛋白表達水平降低；給予不同劑量大黃素干預(yù)后，局灶性腦缺血模型大鼠海馬組織中NF-κB p65蛋白表達水平均明顯降低，IκBα蛋白表達水平升高，提示低、中和高劑量大黃素均能夠抑制NF-κB活性，可能通過抑制NF-κB信號通路調(diào)控IL-6、IL-1β和TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)行為損傷癥狀，減少腦梗死面積[20-21]。

綜上所述，大黃素可通過抑制NF-κB信號通路，降低海馬組織中炎性細胞因子水平，減輕腦組織炎癥反應(yīng)，對局灶性腦缺血有神經(jīng)保護作用，為大黃素應(yīng)用于腦缺血的治療提供了依據(jù)。