核內(nèi)不均一核糖核蛋白D和上皮細(xì)胞黏附分子在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達及其意義

班碩豐，張詩晨，孫一丹，王 婧，韓 冰

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，吉林 長春 130021；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春 130021)

研究[1-2]顯示：口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)發(fā)病率居世界惡性腫瘤發(fā)病率的第六位，也是最常見的頭頸部惡性腫瘤，主要發(fā)生在口腔黏膜如舌、口底、頰和牙齦等處。OSCC經(jīng)常發(fā)生侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]，嚴(yán)重威脅患者生命。核內(nèi)不均一核糖核蛋白D(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D，hnRNPD)亦稱AUF1，是hnRNP家族中的成員，是一種核酸結(jié)合蛋白。研究[4-5]表明：hnRNPD參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)途徑，與炎癥、癌癥、心血管疾病、衰老和病毒感染等多種疾病相關(guān)。上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是一種相對分子質(zhì)量為40 000的跨膜表面糖蛋白。EpCAM在多種上皮源性癌組織中高表達，而在正常上皮組織中低表達，因此被認(rèn)為是一種腫瘤標(biāo)記物[6]。目前有關(guān)hnRNPD和EpCAM在OSCC組織中表達情況的報道較少，并且結(jié)論并不完全一致。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測OSCC患者OSCC組織中hnRNPD和EpCAM表達情況，探討hnRNPD和EpCAM在OSCC組織中表達的意義，為其在OSCC臨床診斷和治療中發(fā)揮作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年6月—2019年6月吉林大學(xué)口腔醫(yī)院手術(shù)切除的38例經(jīng)病理檢查確診的OSCC組織標(biāo)本(OSCC組)，均為原發(fā)病灶。標(biāo)本來源患者均為首次手術(shù)，術(shù)前未經(jīng)放、化療，患者臨床資料完整?；颊吣挲g24～77歲，中位年齡56歲，男性30例，女性8例；臨床TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例，Ⅳ期5例；組織病理學(xué)分級：高分化12例，中分化21例，低分化5例。另在正常拔牙患者口腔內(nèi)采集正常黏膜組織11例(對照組)。

1.2 主要試劑和儀器hnRNPD兔抗人多克隆抗體和EpCAM兔抗人多克隆抗體(美國Proteintech Group Inc公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，枸櫞酸鹽緩沖液和抗體稀釋液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);超薄切片機(德國Leica Biosystems 公司)，顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測OSCC組織和正?？谇火つそM織中hnRNPD和EpCAM表達水平全部組織標(biāo)本離體后立即置于10%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟水化后，采用枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(fù)，按照即用型免疫組織化學(xué)超敏SP檢測試劑盒說明書進行染色。其中hnRNPD一抗(1∶200)和EpCAM一抗(1∶200)4℃孵育過夜，DAB顯色時間控制在1.5～2.0 min，以PBS代替一抗作為空白對照組。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)由病理科醫(yī)師在雙盲條件下對每個樣本切片選取5個癌細(xì)胞聚集的高倍鏡視野，采用Image Pro Plus v6.0分析其平均光密度(mean optical density，MOD)值，以MOD值表示樣本的染色強度。

2 結(jié) 果

2.1 OSCC組織和正常黏膜組織中hnRNPD和EpCAM表達水平OSCC組hnRNPD主要表達在細(xì)胞核，呈棕色或褐色；而對照組hnRNPD染色呈淡黃色或黃色，且著色細(xì)胞數(shù)較少。OSCC組EpCAM主要表達在細(xì)胞膜，少量表達在細(xì)胞質(zhì)，染色呈棕黃色或褐色；對照組EpCAM表達較少且染色減弱。OSCC組和對照組hnRNPD和EpCAM表達水平均呈非正態(tài)分布，方差齊性檢驗結(jié)果顯示：hnRNPD和EpCAM表達水平方差不齊。OSCC組和對照組中hnRNPD和EpCAM表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1(插頁八)和表1。

2.2 OSCC組織中hnRNPD和EpCAM表達水平的相關(guān)性分析38例OSCC患者OSCC組織中hnRNPD表達水平和EpCAM表達水平分別為[1.88(1.06,3.96)]×10-2和[0.35(0.09,1.50)]×10-2,兩者相關(guān)性較弱(Spearman相關(guān)系數(shù)ρ=0.227，P=0.17)，OSCC組織中hnRNPD與EpCAM的表達無相關(guān)性。

表1 正常黏膜組織和OSCC組織中hnRNPD和EpCAM表達水平

2.3 不同臨床病理特征患者OSCC組織中hnRNPD和EpCAM表達水平對38例OSCC組織樣本按照性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分別分組，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗分析結(jié)果顯示：不同性別和不同年齡OSCC患者OSCC組織中EpCAM表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同臨床病理特征OSCC患者OSCC組織中hnRNPD表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征OSCC患者OSCC組織中hnRNPD和EpCAM表達水平

Tab.2 Expression levels of hnRNPD and EpCAM in OSCC tissue of OSCC patients with different clinicopathological parameters

Clinicopathological parameternMOD of hnRNPD(×10-2)ZPMOD of EpCAM(×10-2)ZPGender Male Female3082.11(2.05,3.55)1.28(0.89,1.97)-1.5750.1150.40(0.67,2.16)0.07(0,0.52)-2.4710.013Age(year) ≤60 >6024141.28(1.52,3.20)2.36(1.76,3.78)-1.3320.1830.25(0.26,1.66)0.55(0.27,2.75)-1.9670.049Size of tumor ≤4 cm >4 cm27111.52(1.69,3.21)2.10(1.37,3.95)-0.5310.5950.35(0.46,2.10)0.42(0.11,1.66)-0.1130.910TNM stage Ⅰ-Ⅱ Ⅲ-Ⅳ23151.52(1.62,3.16)2.10(1.53,3.86)-0.4030.6870.32(0.24,1.83)0.63(0.32,2.42)-0.9110.362Pathological stage Ⅰ Ⅱ-Ⅲ12261.27(2.05,3.55)2.36(2.08,3.71)-1.7270.0840.33(0.16,0.90)0.39(0.59,2.33)-0.4080.683Lymph node metastasis Positive Negative28101.52(0.83,3.94)2.03(1.85,3.27)-0.4310.6670.64(0.04,3.21)0.31(0.34,1.66)-0.7290.466

3 討 論

作為一種核酸結(jié)合蛋白， hnRNPD通過與多種mRNA和DNA序列結(jié)合來調(diào)控基因表達，其參與機體多種病理生理過程，如細(xì)胞增殖、分化、衰老、免疫和癌變等。研究[7-9]表明：hnRNPD在多種惡性腫瘤，如甲狀腺癌、乳腺癌、宮頸癌、食管癌和小鼠肺部腫瘤等組織中均呈現(xiàn)過表達，顯示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)。但也有研究[10]表明：hnRNPD有抑制腫瘤的作用。hnRNPD減少了促血管生成因子的產(chǎn)物[11]可能是其抑制腫瘤的機制之一。EpCAM不僅在細(xì)胞間黏附中發(fā)揮作用，還在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖和分化等方面發(fā)揮重要作用，在人體部分正常上皮細(xì)胞和大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中均表達[10]，并且在多數(shù)上皮性腫瘤[6]、腺癌[12]和急性髓細(xì)胞性白血病[13]組織中表達上調(diào)。在正常細(xì)胞中，EpCAM似乎被隔離在緊密的連接中，因此抗體難以接近，而在癌細(xì)胞中，EpCAM廣泛分布在細(xì)胞表面[14-15]。LEE等[16]研究證明：EpCAM在腺樣囊性癌中表達上調(diào)并與多個臨床特征相關(guān)。EpCAM在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、尿路上皮癌和膽囊癌等組織中的高表達與預(yù)后不良相關(guān)，而在腎癌和甲狀腺癌組織中的高表達則與生存率提高有關(guān)[6,17]，這可能是因為EpCAM參與細(xì)胞黏附，也有研究[18]證明：EpCAM基因突變可導(dǎo)致先天性簇狀腸病和林奇綜合征。

OSCC嚴(yán)重威脅患者生命，其發(fā)生與多種信號通路和相關(guān)蛋白的表達有關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示：OSCC組織中hnRNPD和EpCAM表達水平均上調(diào)，顯示二者與OSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)。KUMAR等[20]研究亦證明： OSCC組織中hnRNPD高表達，同時顯示hnRNPD表達與腫瘤大小和腫瘤分期有關(guān)；ZHANG等[21]研究顯示：hnRNPD是OSCC患者生存相關(guān)的剪切因子之一，與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。本文作者進一步分析發(fā)現(xiàn)：hnRNPD表達水平與患者臨床病理參數(shù)無明顯關(guān)聯(lián)，原因可能為本實驗樣本量較少；EpCAM表達水平僅與患者的性別和年齡有關(guān)聯(lián)。SEN等[22]研究證明： OSCC組織中EpCAM高表達，并且其表達情況與腫瘤大小、病理分級、局部腫瘤復(fù)發(fā)情況和患者生存率有關(guān)聯(lián)，而LAIMER等[23]研究結(jié)果則顯示：OSCC組織中EpCAM表達與腫瘤分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和受體狀態(tài)無明顯相關(guān)性。對于EpCAM與臨床病理特征的關(guān)系尚無定論。HAYRY等[24]在研究中采用EpCAM作為標(biāo)志物，對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)細(xì)胞檢測的效果較好。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中往往有2種或多種物質(zhì)發(fā)生協(xié)同或拮抗作用[25-26]。本文作者對hnRNPD和EpCAM表達相關(guān)性分析結(jié)果顯示：OSCC組織中hnRNPD和EpCAM表達水平相關(guān)關(guān)系較弱，提示在OSCC的發(fā)生發(fā)展中，hnRNPD和EpCAM所在的信號通路可能是2個關(guān)聯(lián)較少或不相關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)。

綜上所述，hnRNPD和EpCAM與OSCC存在密切關(guān)聯(lián)。未來仍需進一步研究二者參與OSCC發(fā)生發(fā)展的機制，以期為將hnRNPD和EpCAM表達水平作為OSCC診斷和治療的靶點提供進一步的理論基礎(chǔ)。