搭載紫杉醇脂質體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物靜電紡絲膜對神經干細胞增殖分化的影響

孔維健，方紅娟，潘 肅，楊利麗，鄭 爽，齊治平，付 川，鐘 磊

(1. 吉林大學第二醫院骨科，吉林 長春 130041；2. 吉林省一汽總醫院電診科，吉林 長春 130011)

近年來，如何促進脊髓損傷后肢體運動和感覺功能的恢復受到了較為廣泛的關注。正常脊髓中含有大量功能神經元、神經支持細胞和具有分化潛能的神經干細胞，脊髓損傷后，損傷部位及其下方部位神經元大量壞死及萎縮，瘢痕細胞及炎癥細胞大量增生[1]。脊髓損傷后損傷部位的局部炎性微環境不利于神經干細胞(neural stem cells，NSCs)向神經元分化，大多數NSCs均在炎性微環境誘導下分化為星形膠質細胞和其他支持細胞[2]，替代了正常的脊髓組織，阻礙了神經信號通路的重建。因此誘導NSCs向神經元分化在脊髓損傷恢復研究中具有重要意義。紫杉醇是一種臨床一線抗腫瘤藥物，廣泛應用于乳腺癌和卵巢癌等疾病的治療。高濃度紫杉醇能夠誘導和促進細胞中微管蛋白聚合，穩定微管，進而抑制細胞分裂和增殖，從而發揮抗腫瘤作用[3]。目前有研究[4- 5]顯示：紫杉醇和紫杉醇類似物如埃坡霉素D對于神經退行性病變如阿爾茲海默癥有一定的神經保護作用，其作用機制可能是低濃度紫杉醇能夠阻止軸突回縮球的形成，刺激神經突延伸。生物可降解材料在組織工程學中具有廣泛應用。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)作為一種高分子生物材料，具有降解速率可調和細胞毒性低等優點，在組織工程學研究中具有很大的應用潛力[6]。但PLGA材料的疏水表面不利于細胞在其表面黏附生長[7]。利用靜電紡絲技術可以使PLGA材料表面呈纖維樣交錯分布，有利于細胞在其表面黏附生長[8]。

目前關于紫杉醇脂質體的研究主要集中在其對腫瘤細胞的抗腫瘤效果方面，尚無關于紫杉醇脂質體對NSCs增殖和分化直接影響的研究。PLGA作為一種具有良好應用前景的高分子材料，已經廣泛用于表皮、脊髓和骨組織等組織工程修復研究[9-11]。本研究將紫杉醇和PLGA混合，利用靜電紡絲技術制成靜電紡絲膜，將NSCs在不同種類靜電紡絲膜上進行培養，觀察不同濃度紫杉醇脂質體對NSCs增殖和分化的影響，為脊髓損傷的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器2只孕14 d雌性SD大鼠購自遼寧長生生物技術股份有限公司，體質量350～400 g，動物使用許可證號：SCXK(遼)2015-0001。PLGA(相對分子質量為40 000，長春圣博瑪生物材料有限公司)，紫杉醇脂質體(南京綠葉思科藥業有限公司)，六氟異丙醇(德國Merck公司)，免疫熒光染色一抗Nestin(美國Abcam公司)，Fluor 488綠色熒光二抗(A0428，上海碧云天生物技術有限公司)，DMEM/F12培養基(海克隆公司)，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)(美國Peprotech公司)，MTT試劑盒(型號C0009，上海碧云天生物技術有限公司)，TaKaRa逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。電壓調節直流電源(型號DW-P203-1ACFD，天津東文公司)，掃描電鏡(SEM，荷蘭Philips公司)，激光共聚焦顯微鏡(型號FV3000，日本Olympus公司)。

1.2 搭載紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜的制備靜電紡絲膜的制備方法參照文獻[12]。將100 mg PLGA溶于5 mL六氟異丙醇中，向溶液中加入10 μL不同濃度紫杉醇脂質體，以達到相應藥物濃度(1、5和10 μg·L-1),即為1、5和10 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組。將所得混合溶液移至10 mL注射器中，靜電紡絲膜的制備采用電壓調節直流電源，施加電壓為20 kV，進給速率為1 mL·h-1，發射板和收集板之間距離為10 cm。從收集板上獲得含有不同濃度紫杉醇脂質體的PLGA靜電紡絲膜。采用相同方法制備不含藥物的純PLGA靜電紡絲膜，作為純PLGA靜電紡絲膜組。

1.3 紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜纖維直徑測定利用SEM對所制得的靜電紡絲膜進行檢測，觀察所制得材料的微觀結構和纖維直徑，并測量各組靜電紡絲膜的纖維直徑。

1.4 NSCs分離培養和鑒定從孕14 d雌性SD大鼠腹中胎鼠的大腦皮層中分離出NSCs，在T25培養瓶中以50 000 cm-3的密度進行分離和純化，并在37℃、5% CO2環境中培養。生長培養基中含有5%胎牛血清、2% B27、20 μg·L-1EGF、20 μg·L-1bFGF和100 μg·L-1青霉素-鏈霉素雙抗。培養的原代NSCs每4 d傳代1次，培養基每2 d更換1次。傳代次數在第2～5代NSCs被用于后續的實驗研究。采用免疫熒光染色對所分離得到的細胞進行鑒定。將培養在細胞板中的NSCs采用PBS洗滌3次，每次5 min。向培養板中加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌后吸去上清加入10%血清，室溫下封閉1 h。吸去上清后向每孔中分別加入50 μL一抗，37℃孵育1 h。PBS洗滌后吸去上清液，向孔中加入50 μL熒光二抗(Fluor488)，室溫下孵育1 h后吸去上清，PBS洗滌后滴加DAPI，吸去染劑并經PBS洗滌后封片。利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞在不同抗體標記下的染色結果。

1.5 MTT法檢測各組NSCs增殖活性將細胞密度為30 000 cm-3的NSCs分別加入鋪有不同靜電紡絲膜的細胞板中(1、5和10 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜和純PLGA靜電紡絲膜)，在培養第1、4和7天采用MTT法檢測各組細胞增殖水平。具體實驗步驟按MTT試劑盒說明書進行操作，向每孔中加入50 μL MTT溶液，37℃下孵育4 h。將培養液吸出后離心吸去上清液，各孔中加入100 μL DMSO溶液，低速振蕩10 min后使結晶物充分溶解。將樣品在酶聯免疫檢測儀上于540 nm波長處測量各樣本吸光度(A)值。以A值代表各組NSCs增殖水平。

1.6 RT-PCR法檢測各組NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表達水平將在各組靜電紡絲膜上生長的NSCs培養7 d后，利用PrimeScriptTM試劑盒對NSCs中RNA進行分離和純化。Tuj-1和GFAP分別代表神經元和星形膠質細胞，GADPH作為內參校正基因。各組NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表達水平采用2-ΔΔCt法計算，ΔCt值=目的基因Ct值-管家基因Ct值；ΔΔCt=材料組(目的基因Ct值-管家基因Ct值)-對照組(目的基因Ct值-管家基因Ct值)。RT-PCR擴增引物見表1。

表1 RT-PCR擴增引物序列

2 結 果

2.1 紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜纖維直徑紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜呈白色，質地柔軟，表面呈網格狀，紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜形態見圖1。SEM結果顯示:微觀水平下各組靜電紡絲膜均呈纖維狀相互交錯，純PLGA靜電紡絲膜組靜電紡絲膜平均纖維直徑為1 087 nm，混有紫杉醇脂質體的PLGA靜電紡絲膜纖維直徑與純PLGA靜電紡絲膜比較略有減小。1、5和10 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組靜電紡絲膜纖維直徑分別為1 015 、990 和917 nm，各組纖維直徑比較差異均無統計學意義(P>0.05)。SEM下紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜的超微結構見圖2。

圖1 紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜形態表現

Fig.1 Morphology of paclitaxel-liposome PLGA electrospinning membrane

2.2 免疫熒光染色鑒定NSCs分離和純化免疫熒光染色結果顯示：藍色為細胞核，綠色為Nestin蛋白表達。培養得到的NSCs呈球狀聚集，且多數細胞球中均有Nestin表達，說明通過分離純化得到的細胞均為NSCs，能夠滿足后續的實驗需求。見圖3(插頁六)。

圖2 SEM下紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜的超微結構(Bar=10 μm)

Fig.2 Ultrastructure of paclitaxel-liposome PLGA electrospinning membrane under SEM(Bar=10 μm)

2.3 各組NSCs增殖活性第1天各組NSCs增殖活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。第4天和第7天1、5和10 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs增殖活性與第1天比較有所升高，且高于對應天數的純PLGA組,但組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。第4天5 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs增殖活性高于其他3組(P<0.05)。第7天各組NSCs增殖活性較第4天均有升高，5 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs增殖活性在所有組中仍最高，高于純PLGA靜電紡絲膜組(P<0.05)，但與1和10 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs增殖活性的差距有所減小。見表2。

表2 各組NSCs增殖活性

GroupProliferation level of NSCs (A value)(t/d) 1 4 7 PLGA electrospinning membrane0.246 7±0.020 80.760 5±0.134 51.403 3±0.181 5PLGA electrospinning membrane carrying 1 μg·L-1 paclitaxel-liposomes0.260 0±0.062 40.956 6±0.145 71.733 3±0.187 4PLGA electrospinning membrane carrying 5 μg·L-1 paclitaxel-liposomes0.270 1±0.045 81.580 2±0.124 9*△2.180 0±0.108 2*PLGA electrospinning membrane carrying 10 μg·L-1 paclitaxel-liposomes0.256 7±0.061 10.901 5±0.174 4#1.506 7±0.132 0

*P<0.05vsPLGA electrospinning membrane group;△P<0.05vsPLGA electrospinning membrane carrying 1 μg·L-1paclitaxel-liposomes group;#P<0.05vsPLGA electrospinning membrane carrying 5 μg·L-1paclitaxel-liposomes group.

2.4 各組NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表達水平與純PLGA靜電紡絲膜組比較， 1、5和10 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中Tuj-1 mRNA表達水平升高。1和10 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表達水平與純PLGA靜電紡絲膜組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，5 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中Tuj-1 mRNA表達水平高于其他3組(P<0.05)。隨著靜電紡絲膜中紫杉醇脂質體濃度的增加，NSCs中GFAP mRNA表達水平逐漸減小，純PLGA靜電紡絲膜組NSCs中GFAP mRNA表達水平最高，10 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中GFAP mRNA表達水平最低。見表3。

表3 各組NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表達水平

Group Tuj-1 mRNAGFAP mRNAPLGA electrospinning membrane1.000±0.0001.000±0.000PLGA electrospinning membrane carrying 1 μg·L-1paclitaxel-liposomes1.148±0.1270.935±0.170PLGA electrospinning membrane carrying 5 μg·L-1paclitaxel-liposomes1.764±0.189*△0.677±0.131*PLGA electrospinning membrane carrying 10 μg·L-1paclitaxel-liposomes1.228±0.176#0.403±0.123*△#

*P<0.05 compared with PLGA electrospinning membrane group;△P<0.05vsPLGA electrospinning membrane carrying 1 μg·L-1paclitaxel-liposomes;#P<0.05vsPLGA electrospinning membrane carrying 5 μg·L-1paclitaxel-liposomes.

3 討 論

NSCs在脊髓損傷和神經損傷后再生中具有重要作用，NSCs具有分化為功能性神經元和重建受損神經傳導通路的潛能。但神經損傷后受損部位纖維瘢痕組織增生，形成物理屏障阻礙了損傷部位兩端神經的重新連接[13]。生物材料為結構性損傷中神經細胞的生長和遷移提供了結構基礎，對損傷后神經功能恢復具有積極影響[14]。此外，損傷后局部炎性微環境促進NSCs向星形膠質細胞分化，而不是分化為神經元[15]。星形膠質細胞能夠形成膠質瘢痕，進一步阻礙了損傷部位兩端的功能重建[16]。因此，促進NSCs增殖并向神經元分化對神經損傷后功能恢復具有積極意義。有研究[4]顯示：低濃度紫杉醇能夠阻止軸突回縮球的形成，刺激神經突延伸，對神經系統具有一定的保護作用，但其對NSCs的影響仍不明確。本研究通過構建含有不同濃度紫杉醇脂質體PLGA的靜電紡絲膜，將NSCs在其表面培養，并對上述問題進行了探討。

靜電紡絲技術制備的材料表面呈網格狀，SEM結果顯示靜電紡絲膜表面PLGA纖維相互交錯，有研究[17]顯示：這一粗糙結構有利于細胞在靜電紡絲膜表面黏附生長。與口服或靜脈給藥方式比較，通過生物工程技術制備載有紫杉醇的靜電紡絲膜能夠更好地對藥物濃度加以控制，使藥物以較低劑量直接作用于損傷部位，避免了全身用藥帶來的不良反應。本研究利用免疫熒光染色技術對從胎鼠腦組織中提取出的細胞進行鑒定，結果發現大多數細胞中均有NSCs所特有的Nestin蛋白表達，說明所提取的用于后續細胞實驗的細胞基本均為NSCs，為后續實驗的順利進行奠定了基礎。

本研究結果顯示：隨著培養時間的延長，各組NSCs增殖活性均提高。隨著藥物濃度的增加，5 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs增殖活性明顯高于1 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組，說明在較低濃度范圍內，紫杉醇脂質體對NSCs的增殖具有促進作用；10 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組中NSCs增殖活性低于5 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組，有研究[18]推測：這可能是由于較高濃度紫杉醇對細胞分裂具有抑制作用。

本研究結果顯示：在5 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中，代表神經元生長情況的Tuj-1 mRNA表達水平最高，這說明5 μg·L-1紫杉醇能夠促進NSCs分化為神經元；而10 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中Tuj-1 mRNA表達水平較5 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組有所減少，這可能是由于較高濃度紫杉醇抑制了NSCs增殖。GFAP代表星形膠質細胞中相關基因的表達。隨著藥物濃度的增加，GFAP mRNA表達水平逐漸減少，10 μg·L-1紫杉醇脂質體組NSCs中GFAP mRNA表達水平最低，并且明顯低于1和5 μg·L-1紫杉醇脂質體PLGA靜電紡絲膜組。這可能是因為10 μg·L-1紫杉醇脂質體不僅抑制了NSCs向星形膠質細胞分化，還抑制了NSCs的增殖，使得能夠分化為星形膠質細胞的NSCs數量進一步減少。上述結果說明：中等濃度紫杉醇對于NSCs增殖具有明顯促進作用，并且能夠誘導NSCs向神經元分化，抑制NSCs向星形膠質細胞分化。

神經元再生是脊髓損傷中神經功能恢復的基礎，新生神經元可以進一步分化為運動神經元或感覺神經元，替代受損的神經細胞，在一定程度上恢復原有的神經功能[19]。星形膠質細胞是神經系統中一種常見的支持細胞，在正常組織中的星形膠質細胞包裹在神經元周圍，對神經細胞具有保護作用[20]。但在損傷后，損傷區域的炎性微環境刺激星形膠質細胞過度生長形成屏障，阻礙神經元重建神經信號通路，對神經功能的恢復產生不利影響[21]。因此，促進神經元形成并抑制星形膠質細胞生長有利于神經功能的恢復。

本研究利用靜電紡絲技術構建了載有紫杉醇脂質體的PLGA靜電紡絲膜，將從動物體內提取的NSCs培養在含有不同濃度藥物的靜電紡絲膜上，并對其增殖分化情況進行了檢測。本研究結果表明:5 μg·L-1紫杉醇能夠促進NSCs增殖，并誘導NSCs向有利于神經功能恢復的方向進行分化，應用中等濃度紫杉醇治療脊髓損傷具有一定可行性，搭載中等濃度紫杉醇脂質體的PLGA靜電紡絲膜在治療脊髓損傷中具有潛在的應用前景。