海參糖胺聚糖催化自由基降解及其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

張培義

(華測檢測認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司惠州分公司，廣東 惠州 516083)

海參是棘皮動(dòng)物門海參綱動(dòng)物，其具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)血潤燥、溫經(jīng)通絡(luò)等功效。海參體壁內(nèi)包含酸性粘多糖類物質(zhì)，其中包括海參糖胺聚糖(簡稱SC-GAG)，其是一種類肝素抗凝劑，具有抗凝血、抑制血小板聚集、防治急性放射性損傷作用，可明顯促進(jìn)造血功能的恢復(fù)和增強(qiáng)。然而，這種從海參中提取的分子量大的糖胺聚糖存在著容易引起血小板聚集等副作用。Toshio I.等[1]的研究結(jié)果顯示，低分子量的海參糖胺聚糖比未解聚的多糖在藥效上具有顯著的優(yōu)勢。低分子海參糖胺聚糖由于分子量減小，不容易被細(xì)胞外基質(zhì)、血漿蛋白和細(xì)胞受體結(jié)合滅活，因此生物利用度更高。此外，低分子海參糖胺聚糖對血小板的影響減小，降低了因影響血小板功能而導(dǎo)致的出血合并癥發(fā)生的可能性。因此，在不改變海參糖胺聚糖基本活性結(jié)構(gòu)的條件下，采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽淦涞头肿恿康漠a(chǎn)物，已引起廣大研究者的高度關(guān)注。

有研究者已采用過氧化氫法成功地實(shí)現(xiàn)了肝素[2]、海帶硫酸多糖[3]等的降解。Ken-ichiro Y.等[4]首先應(yīng)用過氧化氫解聚的方法制備得到了低分子海參糖胺聚糖，其研究結(jié)果顯示，解聚前后海參糖胺聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生顯著的變化，這證明了該法的可行性。但該法存在著反應(yīng)時(shí)間較長、反應(yīng)條件苛刻、工藝過程較難控制的缺點(diǎn)，直接給低分子產(chǎn)物的質(zhì)量穩(wěn)定性帶來了風(fēng)險(xiǎn)。

本文在前人的研究基礎(chǔ)上，把金屬離子催化劑引入反應(yīng)體系，采用過氧化氫降解法來降解粗海參糖胺聚糖，并針對海參糖胺聚糖的催化自由基解聚過程，結(jié)合自由基無規(guī)隨機(jī)解聚的過程機(jī)制，建立反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。提出帶支鏈巖藻糖的糖胺聚糖的解聚反應(yīng)機(jī)理過程。

1 材料和儀器

1.1 材料

海參糖胺聚糖,自制；

過氧化氫(30%，分析純),天津富宇化工廠

三水合乙酸鈉(分析純),汕頭西隴化工廠

氯化鈉(分析純),汕頭西隴化工廠

乙酸鋅(分析純),天津大茂化學(xué)試劑廠

乙二胺四乙酸二鈉(分析純),汕頭西隴化工廠

001×7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂,南開大學(xué)化工廠

1.2 儀器

DL-6M臺(tái)式低俗大容量離心機(jī),湘儀離心機(jī)；

DZF-6050型真空干燥箱,上海精宏有限公司；

DSK-26型不銹鋼新型電熱恒溫水浴鍋,嘉興中新醫(yī)療儀器公司；

高效液相色譜儀Agilent technologies1200 series,Agilent；

切向流超濾儀,Millipore。

2 海參糖胺聚糖的降解反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

過氧化氫氧化降解海參多糖的過程中過氧化氫同金屬離子反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基OHo, 羥自由基OHo帶有一個(gè)不成對的電子，性質(zhì)極為活潑，易攻擊破壞其臨近的海參糖胺聚糖大分子，使其降解。

以某金屬陽離子Mn+為例羥自由基產(chǎn)生過程為[#5]：

Mn++ H2O2→Mn+1++OH·+ OH-

Mn++ OH· →Mn+1++ OH-

Mn+1++ HOO·→Mn++ H++O2

2. 2 實(shí)驗(yàn)過程

分別取5g海參糖胺聚糖，加入200mL水溶解，加入終濃度為0.5mol/L氯化鈉，0.5mol/L三水乙酸鈉，以10mL/h的速度滴加濃度為10%的過氧化氫20 mL，加入1mL濃度為1mol/L的乙酸鋅為催化劑，分別于25，35，45，55℃水浴中反應(yīng)，反應(yīng)過程中pH值控制在7.5左右。每組實(shí)驗(yàn)分別于20，40，60，80，100，120min取樣，求得每組不同時(shí)間降解產(chǎn)物的分子量，考察催化自由基降解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

3 動(dòng)力學(xué)模型的建立

通過對海參糖胺聚糖解聚前后的紅外光譜數(shù)據(jù)、單糖分析結(jié)果以及核磁數(shù)據(jù)結(jié)果的比較分析發(fā)現(xiàn)，支鏈巖藻糖在解聚過程中沒有發(fā)生明顯的脫落，三個(gè)單糖的摩爾比也沒有發(fā)生顯著的變化，因此，我們有理由認(rèn)為海參糖胺聚糖中的β-D-葡萄糖醛酸(1→3)-硫酸酯化-β-D-N-乙酰氨基-半乳糖和硫酸酯化-β-D-N-乙酰氨基-半乳糖(1→4) β-D-葡萄糖醛酸中的糖苷鍵在斷裂的機(jī)會(huì)上是均等的，并且硫酸酯化-α-L-巖藻糖(1→3)- β-D-葡萄糖醛酸的糖苷鍵不被斷裂。

從而，可以假設(shè)海參糖胺聚糖的自由基解聚滿足無規(guī)解聚過程，則定義：

α=s/(N。-1)

(1)

式中：s為因水解而斷裂的鍵數(shù)，N。為海參糖胺聚糖的初始聚合度，a為大分子中每一縮醛鍵在某一確定時(shí)刻的裂解幾率。假設(shè)海參糖胺聚糖降解是單分子反應(yīng)，則降解速率ds/dt與未斷裂的縮醛鍵數(shù)成正比，即：

ds/dt = k(N。- 1- s)

(2)

積分得：

s = (N0-1)[1- exp(-kt)]

(3)

式中：s 與 a 是解聚進(jìn)行時(shí)間為t時(shí)的斷鍵數(shù)目和降解程度；k為水解速率常數(shù)，所以：

a = 1- exp(- kt)

(4)

在時(shí)間t時(shí)，水解系統(tǒng)的平均聚合度為Nn ，起始聚合度為N。，則：

Nn=N。/(s+1)

(5)

合并式(3)和式(5)，消去s 得：

(Nn-1)/Nn=(N0- 1)/No·exp(-kt)

(6)

等式兩邊分別取對數(shù)，則得：

ln[Nn /(Nn - 1)]=-ln[N。/(N。-1)]+kt

(7)

以ln[Nn /(Nn - 1)]對 t 作圖，應(yīng)為直線關(guān)系，直線的斜率為k。根據(jù)Arrhenius公式[6]，則有

k=Aexp(-E/RT)

(8)

式中：A 是經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，E是降解反應(yīng)的表觀活化能，T是熱力學(xué)溫度，R是理想氣體常數(shù)，兩邊取對數(shù)，可以得到：

lnk=lnA-E/RT

(9)

用lnk對-l/RT作圖，即可求出反應(yīng)的活化能。

4 動(dòng)力學(xué)模型的試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)式(7)以ln[Nn /(Nn - 1)]對t作圖，結(jié)果見圖1。由圖2所示，在實(shí)驗(yàn)溫度下，ln[Nn /(Nn - 1)]與 t呈線性關(guān)系。

圖1 不同溫度下ln[Nn/(Nn - 1)]與t的關(guān)系曲線Fig.1 Relationship curve of ln[Nn/(Nn - 1)] and t in different temperature

圖2 lnk與-1/RT的關(guān)系曲線Fig.2 Relationship curve of lnk and -1/RT

對不同溫度下ln[N /(N -1)]-t曲線，進(jìn)行線性回歸所得直線的斜率即為k值，結(jié)果見表1。由表1可見，其回歸系數(shù)均在0．989以上，說明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，糖胺聚糖的降解較好地符合無規(guī)降解過程。此外，隨著溫度的升高，降解的表觀速率常數(shù)逐漸增大。

表1 不同溫度下所得k值與R值Tab.1 Result of k and R in different temperature

根據(jù)式(9)以lnk對-1/RT作圖，結(jié)果見圖2。由圖2中直線的斜率便可得到海參糖胺聚糖降解反應(yīng)的活化能E為16.47kJ/mol，回歸系數(shù)為0．994。回歸系數(shù)較高。因此，通過試驗(yàn)驗(yàn)證糖胺聚糖的降解較好地符合無規(guī)降解過程。并在該基礎(chǔ)上求得海參糖胺聚糖降解反應(yīng)的活化能E為16.47kJ/mol。