蘆筍老莖皂苷的急性毒性

朱興磊，張 凌

（1） 云南師范大學學報編輯部，云南昆明 650092；2） 中國科學院昆明植物研究所《應用天然產物（英文）》編輯部，云南昆明 650201）

蘆筍（Asparagus officinalis L.） 學名石刁柏，百合科天門冬屬植物，其嫩莖是具有很高營養價值的名貴蔬菜。蘆筍主要作為新鮮蔬菜和蘆筍罐頭食用，但其可食用部分—嫩莖僅占整株生物學產量的60%左右，而近40%的老莖則在加工過程中被丟棄[1]，不僅浪費資源，也增加環境負擔。研究顯示這些廢棄物中含有皂苷、黃酮和多糖等活性物質[2-3]，其中的皂苷是蘆筍的主要活性因子，是蘆筍抗癌的主要成分，可誘導急性髓性白血病細胞（HL-60）[4]、人肝癌細胞（HepG-2） 和人胃癌細胞（SGC-7901） 凋亡[5-6]。且廢棄的蘆筍老莖中的皂苷含量雖然比嫩莖少，但也達到嫩莖含量的60%[2，7]，說明其具有開發利用的潛力。Wang 等人[8]的研究表明從蘆筍老莖中分離得到的皂苷能夠抑制乳腺、結腸和胰腺腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲。此外，筆者的前期研究顯示蘆筍老莖皂苷（saponins from old stems ofAsparagus officinalis L.，SAO） 對高糖高脂飲食引發的高脂血癥具有顯著的預防和治療作用[9-10]，對糖尿病大鼠也有明顯的降血糖作用[11]，可見SAO 具有良好的開發和應用前景，但目前對其的安全性評價未見報道。

實驗研究SAO 對ICR 小鼠經口給藥后的急性毒性，為SAO 的安全性評價和深入開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SAO 的制備 蘆筍老莖干材料用70%的乙醇（料液比1:10） 80°C 提取，所得提取液減壓濃縮后用水飽和正丁醇1:1 萃取，萃取液減壓濃縮后真空干燥，所得棕色固體再經AB-8 型大孔樹脂純化后冷凍干燥得到淺棕色粉末，即為SAO 成品。從文獻可知，蘆筍中的皂苷主要是甾體皂苷，其母核皂苷元為菝葜皂苷元[12-13]，因此參照趙芳春等人[14]的方法，以菝葜皂苷元為對照品，測得SAO中總皂苷的質量分數為55%～59%。

1.1.2 試驗動物 ICR 小鼠64 只，雌雄各半，清潔級，體重18～22 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限責任公司，試驗動物合格證號：SCXK（滬） 2013-0016。動物飼養環境溫度23～25℃（由空調控制），12 h 明暗輪換（8:00-20:00），通風，動物自由攝食和飲水。

1.1.3 藥品和試劑 血清葡萄糖（Glu）、血清總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C） 及甘油三酯（TG） 測定試劑盒購自上海科欣生物技術研究所；其他試劑國產分析純。

1.1.4 儀器 RE-52 型旋轉蒸發儀為上海博通經貿有限公司生產，酶聯免疫測定儀為美國BIO-TEX 公司生產，BS210S 型電子天平為德國Sartorius 公司生產，高速臺式冷凍離心機為上海安亭科學儀器廠生產，冷凍干燥儀為美國SP Scientific-FTS 公司生產。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 適應性喂養5 d 后，將64 只ICR 小鼠隨機分為4 組，每組16 只，雌雄各半，即正常對照組和3 個SAO 給藥組，給藥組劑量分別為500、1 000 mg/kg 和4 000 mg/kg。給藥前小鼠禁食不禁水12 h，按20 mL/kg 的體積一次性灌胃給藥，對照組灌服等體積蒸餾水，給藥后4 h 恢復自由飲食和飲水，灌胃后連續觀察14 d。

1.2.2 觀察指標（1） 一般狀態觀察小鼠的皮毛、呼吸、眼睛、鼻子、分泌物、排泄物以及神經系統（行為、反應及運動） 等方面的變化情況，詳細記錄小鼠毒性反應的癥狀、出現和消失的時間以及死亡情況。給藥后8 h 連續密切觀察，以后每天觀察記錄1 次，連續觀察14 d；（2） 攝食量、飲水量和體質量每天監測小鼠的攝食量和飲水量，0 d（給藥前）、7 d 和14 d 測量小鼠體質量；（3）血液指標 小鼠給藥14 d 時禁食8 h，采血并分離血清，按試劑盒說明書的操作測定血清Glu、TC、TG 和HDL-C 水平；（4） 臟器系數小鼠給藥14 d采血后處死，解剖，取心、肝、脾和腎等臟器，稱重，并計算臟器系數。臟器系數計算公式為：臟器系數=臟器質量/體質量×100。

1.3 統計學處理

數據采用SPSS 軟件進行統計分析，結果以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。同時用SPSS 21.0 軟件進行機率單位加權回歸法（Bliss 法） 計算SAO 對ICR 小鼠的半數致死量（LD50）[15]。

2 結果

2.1 毒性反應表現

正常對照組小鼠精神狀態良好，被毛光亮，無異常分泌物，糞便正常，試驗期內無死亡；SAO 500 mg/kg 組小鼠無明顯毒性反應，呼吸、行為、反應及運動無明顯異常，糞便正常，無異常分泌物，試驗期內無死亡。SAO 1 000 mg/kg 組在給藥15 min 后有2 只小鼠出現活動減少和俯臥，另有2只小鼠出現輕微抽搐，但均在2 h 后恢復正常，無異常分泌物，糞便正常，試驗期間無死亡；SAO 4 000 mg/kg 組小鼠在給藥10 min 后出現明顯毒性反應，表現為抽搐，15 min 起有小鼠出現轉圈和竄跳后死亡，共有11 只小鼠死亡，死亡時間均在給藥后2 h 內，死亡的小鼠解剖后未見器官異常，存活的5 只小鼠在剩余的觀察期內，除活動較少外沒有發現其他異常的現象。

2.2 SAO 對小鼠的LD50

根據小鼠的毒性反應情況，在本試驗條件下測得SAO 對小鼠的最大無毒性反應劑量為500 mg/kg；根據小鼠的死亡情況，計算得出SAO 對ICR 小鼠經口給藥的LD50 為3460 mg/kg。

2.3 SAO 對小鼠體質量的影響

試驗期間各組小鼠的體質量變化情況見表1，與正常對照組小鼠相比，500 mg/kg 和1 000 mg/kg的SAO 對小鼠的體質量沒有明顯影響（P＞0.05），但SAO 400 0 mg/kg 組存活的5 只小鼠的體質量在給藥后7 d （P＜0.05） 和14 d （P＜0.05） 都明顯高于正常對照組。

2.4 SAO 對小鼠攝食量和飲水量的影響

各組小鼠的攝食量和飲水量見表2，與正常對照組相比，500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的SAO 對小鼠的攝食量和飲水量均無顯著影響（P＞0.05）；SAO 400 0 mg/kg 組存活小鼠的攝食量與正常對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），但飲水量顯著高于正常對照組（P＜0.05）。

表1 蘆筍老莖皂苷對小鼠體質量的影響［（），g］Tab.1 Effect of SAO on body weight of mice in different groups ［（），g］

表1 蘆筍老莖皂苷對小鼠體質量的影響［（），g］Tab.1 Effect of SAO on body weight of mice in different groups ［（），g］

與正常對照組比較，*P ＜0.05。

2.5 SAO 對小鼠主要臟器系數的影響

SAO 對小鼠主要臟器系數的影響見表3，與正常對照組小鼠相比，500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的SAO 對小鼠心、肝、脾和腎的臟器系數均無明顯影響（P＞0.05）；SAO4000 mg/kg 組存活小鼠的心、肝和腎的臟器系數與正常對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），但脾的臟器系數明顯低于正常對照組（P＜0.05）。

表2 蘆筍老莖皂苷對小鼠攝食量和飲水量的影響（）Tab.2 Effect of SAO on food and water consumption of mice in different groups （）

表2 蘆筍老莖皂苷對小鼠攝食量和飲水量的影響（）Tab.2 Effect of SAO on food and water consumption of mice in different groups （）

與正常對照組比較，*P ＜0.05。

2.6 SAO 對小鼠血糖和血脂水平的影響

SAO 對小鼠血糖和血脂水平的影響見表4，與正常對照組相比，500 mg/kg 的SAO 對小鼠血清Glu、TC、TG 和HDL-C 水平均無顯著影響（P＞0.05）；SAO1000 mg/kg 組小鼠的血清TC、TG 和HDL-C 水平與正常對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），但血清Glu 水平明顯低于正常對照組（P＜0.05）；SAO4000 mg/kg 組存活小鼠的血清Glu、TC 和HDL-C 水平與正常對照組相比無顯著差異（P＞0.05），但血清TG 水平明顯低于正常對照組（P＜0.05）。

表3 蘆筍老莖皂苷對小鼠主要臟器系數的影響（）Tab.3 Effect of SAO on organ coefficient of mice in different groups （）

表3 蘆筍老莖皂苷對小鼠主要臟器系數的影響（）Tab.3 Effect of SAO on organ coefficient of mice in different groups （）

與正常對照組比較，*P ＜0.05。

表4 蘆筍老莖皂苷對小鼠血糖和血脂水平的影響［（），mmol/L］Tab.4 Effect of SAO on serum glucose and lipid levels of mice in different groups ［（），mmol/L］

表4 蘆筍老莖皂苷對小鼠血糖和血脂水平的影響［（），mmol/L］Tab.4 Effect of SAO on serum glucose and lipid levels of mice in different groups ［（），mmol/L］

與正常對照組比較，*P ＜0.05。

3 討論

急性毒性試驗是指對動物一次或24 h 內多次給藥，觀察動物的中毒癥狀和死亡情況，從而初步評價受試物的毒性及主要靶器官，是新藥安全性評價的第一步[16-17]。本試驗采用ICR 小鼠進行SAO 經口給藥的急性毒性試驗，結果表明SAO 的LD50為3 460 mg/kg，根據聯合國世界衛生組織推薦的五級分級標準，屬于低毒性，且筆者前期的研究表明40 mg/kg 的SAO 即有明顯的降血脂和降血糖作用[9-11]，遠遠低于SAO 的LD50。

試驗期間所有觀察到的小鼠死亡均發生在給藥后2 h 內，根據小鼠的毒性反應和死亡時間，推測SAO 具有一定的神經毒性。500 mg/kg 和1000 mg/kg 的SAO 對小鼠的體質量、攝食量和飲水量均無顯著影響，但SAO 4000 mg/kg 組存活小鼠的體質量和飲水量明顯高于正常對照組（P＜0.05），但具體的原因還有待進一步研究；臟器系數是評價藥物對臟器影響狀況的重要指標，可在一定程度上反映藥物毒副作用的靶器官[18-19]。脾臟是機體內重要的免疫器官，在造血及各種免疫活動中均起到重要作用，脾臟指數的變化可以反映機體免疫功能的狀態[18-19]。500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的SAO 對小鼠的主要臟器系數無顯著影響，但SAO 4 000 mg/kg 組存活小鼠脾臟的臟器系數明顯低于正常對照組小鼠（P＜0.05），說明該劑量的SAO 對小鼠的脾臟具有一定的毒性，致使脾臟有所萎縮，但具體原因還有待進一步研究。500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的SAO 對小鼠的血清TC、TG 和HDL-C 水平無明顯影響，但與正常對照組相比，SAO 1 000 mg/kg 組小鼠血清Glu 明顯降低，SAO 4 000 mg/kg 組小鼠血清TG明顯降低，這可能與SAO 的降血糖和降血脂作用有關，但具體原因還需深入研究。

研究為蘆筍老莖皂苷的安全性評價和深入開發利用提供參考，但若要全面評價其安全性，還需要進行長期毒性試驗。