不同條件下工業大麻中大麻二酚含量變化

孫孔春 ，陳興龍，楊璨瑜，于浩飛，胡煒彥，王 蕊，沈報春，張榮平

（1） 昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室；2） 法醫學院，云南昆明 650500；3） 云南中醫藥大學中藥學院，云南昆明 650500）

工業大麻（Cannabis sativa L.） 為一年生草本植物，又名大麻、漢麻、火麻[1]，主要應用于食品、制藥、紡織、化妝品等行業。其中的大麻二酚（CBD） （結構式見圖1） 是大麻中的非毒性和非成癮性成分，能阻礙THC 對人體神經系統的不利影響，是大麻酚類物質中最重要的生理活性成分之一，據文獻報道，其對于抗焦慮，鎮痛、抗失眠、阿爾茨海默病和抗驚厥[2-7]等有一定療效。在工業大麻產業合法化的同時，分析測定大麻二酚的含量并考察其在提取前處理過程中不同條件對其含量變化的影響，對于在工業生產中大麻二酚的提取具有極其重要的意義。

本文建立了HPLC 分析測定CBD 含量的方法，考察CBD 在工業大麻不同部位，不同烘烤溫度，不同烘烤時間，不同PH 條件等前處理條件下CBD的含量變化，為工業生產提供技術依據。

圖1 大麻二酚結構式Fig.1 The structural formula of Cannabidiol

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

島津LC-2010A 高效液相色譜儀，島津SPD-M10AVP 檢測器，島津LC solution 色譜工作站；色譜柱：InertSustain C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；電子天平（BSA124S）：北京賽多利斯科學儀器有限公司；超聲清洗儀（SK3200H）：上?？茖С晝x器有限公司；0.22 μm 尼龍微孔濾頭：天津市津騰試驗設備有限公司；一次性使用無菌注射器5 mL、2.5 mL：陜西龍康鑫醫療器械有限公司；20 μL、100 μL、200 μL 及1 000 μL移液槍：Eppendorf Research plus。

1.2 實驗樣品及試劑

甲醇（分析純，江蘇漢邦科技有限公司）、超純水（超純水儀，倍捷科技有限公司），大麻二酚對照品（西安百川生物科技有限公司生產）；工業大麻（云麻七號，云南森牧源生物科技有限公司）。

1.3 對照品及供試品溶液的制備

1.3.1 對照品溶液的配制 取CBD 對照品適量，精密稱定，用甲醇配成濃度為100 μg/mL 對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的配制 分別稱取各大麻供試品約0.2 000 g，于試管中加入約8 mL 正己烷-乙酸乙酯（V/V 9:1） 溶液，超聲5 min，靜置90 min，離心15 000 r/min，10 min，收集上清液至10 mL 容量瓶中，定容，搖勻，備用。

1.4 方法學研究

1.4.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；以甲醇-水（85：15） 為流動相進行等度洗脫。在此色譜條件下，取CBD 對照品和工業大麻樣品分別進樣分析。

1.4.2 線性關系的考察 精確稱取CBD 對照品，照1.3.1 下方法配制得到100 μg/mL 的對照品溶液，再按1.4.1 下色譜條件分別進樣1、5、10、20、50 μL，記錄保留時間和峰面積。

1.4.3 精密度和重復性試驗 精密吸取1.3.1 下方法配制的同一份供試樣品溶液，按1.4.1 下色譜條件連續進樣6 次，記錄CBD 保留時間及峰面積；取同一份供試藥材工業大麻，按1.3.2 下方法平行操作制備5 份樣品，分別按1.4.1 下色譜條件進樣，記錄CBD 保留時間及峰面積，計算各物質保留時間和峰面積的RSD%，分別考察該方法的精密度和重復性。

1.4.4 穩定性試驗 按1.3.2 下方法配制供試樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按1.4.1 下色譜條件進樣10 μL 測定，記錄CBD 保留時間及峰面積，計算各物質的保留時間和峰面積的RSD%。

1.4.5 加樣回收率 向已知大麻二酚含量的工業大麻樣品供試品中，精密加入一定量的CBD 對照品，計算實測值與供試品中含有量之差，再除以加入對照品量計算回收率。

1.5 樣品含量測定

取分別經不同烘烤溫度，不同烘烤時間，不同PH 處理后的工業大麻樣品，按1.3.2 下方法配制成供試品溶液，精密吸取10 μL 注入液相色譜儀，記錄保留時間及峰面積，將所得結果帶入CBD 標準曲線，計算工業大麻樣品中CBD 的含量。

2 結果

2.1 方法學研究結果

2.1.1 工業大麻中CBD 及樣品HPLC 色譜圖 按1.3.1項下方法配制對照品溶液，按1.4.1 下色譜條件進樣，記錄CBD 對照品色譜圖（圖2）；按1.3.2項下方法配制供試品溶液，取按1.4.1 下色譜條件進樣，記錄工業大麻樣品色譜圖（圖3）。

圖2 CBD 對照品色譜圖Fig.2 The chromatogram of cannabidiol reference substance

圖3 工業大麻樣品色譜圖Fig.3 The chromatogram of Industrial hemp sample

2.1.2 線性關系 按1.4.2 下方法操作，將結果以質量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。得到CBD 線性回歸方程為：Y=4×106x+17126，相關系數R2=0.9990，在0.000 1～0.005 mg 范圍內線性關系良好。

2.1.3 精密度試驗和重復性試驗 按1.4.3 下方法操作，記錄峰面積，精密度實驗計算得到工業大麻中CBD 峰面積的RSD%為0.11%，結果表明儀器精密度和操作精密度良好；重復性實驗計算得到工業大麻中CBD 峰面積的RSD%為0.41%，符合規定，結果表明方法重復性良好。

2.1.4 穩定性試驗 按1.4.4 下方法操作，記錄峰面積，穩定性實驗計算得到工業大麻中CBD 峰面積的RSD%為0.88%，結果表明樣品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.5 加樣回收率 按1.4.5 下方法操作，記錄峰面積，計算得到工業大麻中CBD 峰加樣回收率，具體結果見表1，加樣回收率在范圍內，結果表明方法準確度可靠。

2.2 含量測定結果

按1.5 下方法操作，記錄保留時間及峰面積，將所得結果帶入CBD 標準曲線，計算經不同烘烤溫度，不同烘烤時間，不同pH 條件處理后工業大麻中CBD 的含量，結果表明：工業大麻的大麻葉子中CBD 含量較高，且在120 ℃條件下，烘烤40 min 條件下能夠明顯提高大麻葉中CBD 的含量，強堿條件對CBD 的穩定性造成影響。具體結果詳見表2～7，大麻葉在不同烘烤溫度下CBD 含量變化見圖4。

進一步細化時間點，采取直接放入樣品再升溫烘烤或者升溫后再放入樣品烘烤兩種方式，以5 min 為時間單位，在不同的時間點取樣，測定CBD含量，結果表明：兩種烘烤方式對大麻葉中CBD含量影響不大，在40 min 時用CBD 含量較高，詳細結果見表5～6。

取約1 mg CBD 樣品，加乙醇溶解，分別用鹽酸和氫氧化鉀調節pH 為1，7，和11，放置0，5 和15d 考察不同pH 值對CBD 含量的影響，結果見表7。

表1 加標回收率試驗結果Tab.1 The result of recovery rate test

表2 大麻葉、種子以及莖中CBD 含量測定結果Tab.2 The results of CBD determination in cannabis leaves，seeds and stems

表3 大麻葉在不同烘烤溫度下CBD 含量測定結果Tab.3 The results of CBD determination of cannabis leaves at different baking temperatures

表4 大麻葉在120 ℃時的不同烘烤時間下CBD 含量測定結果Tab.4 The results of CBD determination of cannabis leaves at different baking times at 120℃

表5 直接放入大麻葉樣品再升溫至120 ℃烘烤后的不同時間點下CBD 含量測定結果Tab.5 The results of CBD content measurement at different time points after the cannabis leaf samples were directly placed and heated to 120 ℃

表6 升溫至120 ℃再放入大麻葉樣品烘烤后的不同時間點下CBD 含量測定結果Tab.6 The results of determination of CBD content at different time points after heating to 120 ℃and placing in cannabis leaf samples after baking

表7 CBD 在不同pH 條件以及不同放置時間下的含量測定結果Tab.7 The determination results of CBD under different pH conditions and different storage times

圖4 大麻葉在不同烘烤溫度下CBD 含量變化圖Fig.4 The changes of CBD content in hemp leaves at different baking temperatures

3 討論

由表2 可得：工業大麻的大麻葉、種子以及莖中CBD 含量差別較大，在CBD 提取過程中應該選取葉子，盡量避免摻入種子和莖。

由表3 可得：將工業大麻葉在不同溫度下烘烤30 min，測定其中CBD 的含量，研究結果表明以一定的溫度對大麻葉進行烘烤能夠提高大麻葉中CBD 的含量，并且以120 ℃的溫度進行烘烤含量提高最明顯。

由表4 可得：將工業大麻葉在120 ℃的條件下，選擇不同烘烤時間，對其CBD 含量進行測定，發現在烘烤40 min 的時候CBD 含量最高，說明烘烤時間對CBD 的含量造成了一定影響。

由表5、表6 可得：采取直接放入樣品再升溫烘烤或者升溫后再放入樣品烘烤兩種方式，以5 min 為時間單位，在不同的時間點取樣，發現兩種烘烤方式對大麻葉中CBD 含量影響不大，均在40 min 時用CBD 含量最高。以上研究結果表明在120℃條件下，烘烤40 min 能夠明顯提高大麻葉中CBD 的含量。

由表7 可得：測定結果表明pH 值會對CBD的穩定性造成影響，且強堿性條件的影響更為明顯，隨著時間的推移，CBD 逐漸降解。

本實驗參考大麻二酚含量測定的相關文獻[8]，建立HPLC 法測工業大麻中大麻二酚的含量，由圖2 可以看出，大麻二酚保留時間為8.982 min，該法可簡單、快速測定工業大麻中大麻二酚的含量。

大麻二酚在大麻葉中含量較高，于烘烤溫度為120 ℃時，烘烤40 min 條件下能夠明顯提高大麻葉中CBD 的含量，且大麻二酚在強堿性條件下易降解為其它物質，本實驗為工業中提取大麻二酚處理過程提供技術依據。