致病性糞腸球菌YN771 的分離鑒定及其生物學特性

向盈盈 ，于鴻濱，周 靜，楊向紅，宋 飛，魏云林，季秀玲

（1） 昆明市延安醫院口腔科，云南昆明 650031；2） 昆明醫科大學第三附屬醫院微創介入科，云南昆明 650106；3） 昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650500）

在臨床中，糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是院內感染的常見和主要條件致病菌，可引起泌尿道[1]、生殖道、腹腔、盆腔、手術傷口、血液感染及口腔感染[2]。

口腔感染性疾病中的難治性根尖周炎（Refractory periapical periodontitis） 又稱頑固性根尖周炎，是指經反復多次規范根管治療仍遷延不愈的疾病，它是口腔醫師面臨的棘手問題，也是牙髓病臨床治療的難題。該病可以造成患者復發性根尖周膿腫和進行性骨質破壞，并導致牙齒喪失和牙槽骨缺損，嚴重影響患者的治療效果和生存質量。研究證實糞腸球菌（E.faecalis） 是根管治療后再感染和難治性根尖周炎的主要病原菌[3-4]，糞腸球菌的檢出率與根尖周破壞呈正相關[5]。在根管治療后持續性感染的根尖周糞腸球菌檢出率明顯增高，最高達77%[6]，糞腸球菌甚至成為根管治療后根管再次感染的唯一檢出細菌。因此，控制糞腸球菌感染在根管治療中十分重要，徹底清除糞腸球菌是提高難治性根尖炎治愈率的關鍵。

本研究從昆明市延安醫院口腔科再治療根管中采集根管內細菌樣本，分離樣本中的致病性糞腸球菌，對其進行鑒定，并研究其生物學特性，為臨床治療難治性根尖周炎提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

心腦培養基（Brain Heart Infusion）：簡稱BHI培養基，OXOID，英國貝星斯托克。

1.2 樣本采集對象

自2016 年1 月至12 月就診于昆明市延安醫院口腔科門診的患者中選取需進行根管再治療的21 名人員，其中男性9 名，女性12 名，年齡18～50 歲。所有患牙均因患牙根管治療后疼痛前來就診，需要進行根管再治療。

排除標準：口內齲齒、根尖竇道或瘺管、牙周病（牙周探診深度＞5 mm）、懷孕及本次治療前6 個月內局部或者全身性使用過抗生素的患者。所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 抗生素抗性平板的配制 將青霉素G、克林霉素、氨芐西林加無菌蒸餾水溶解后，過濾除菌后備用。四環素加入乙醇溶解，四種抗生素貯存液的濃度均調整為10 mg/mL。將已滅菌的四瓶BHI 瓊脂培養基冷卻到50℃左右，分別加入上述四種抗生素（終濃度為10 μg/mL），搖勻后倒平板。

1.3.2 樣本的采集 在患者治療過程中完成再治療根管內糞腸球菌樣本的采集工作，采集方法參照Pinheiro[7]文獻報道的方法并加以改進。整個操作過程保證嚴格無菌操作。首先用橡皮障隔離患牙，去除患牙冠部的充填體、去盡齲壞組織、暴露根管口，用3%過氧化氫液和25 g/L 次氯酸鈉液交替清潔牙面，然后用GG 鉆和不銹鋼K 銼去除原根充物（注意：這一過程不使用任何化學溶劑）。再用根管測量儀測定根管工作長度，接著用生理鹽水沖洗根管去除殘留的根充物并使根管保持濕潤狀態，最后將干燥無菌紙尖插入根管并達到工作長度，停留60 s 后將紙尖轉至BHI 液體培養基內。

1.3.3 致病菌的分離及培養 37℃，150 r/min，有氧條件下孵育24 h 后觀察。如果培養基變渾濁，證明培養基中有細菌生長；如果培養基清亮或者顏色無變化則認為培養基中無細菌生長，陰性結果。

取培養基變渾濁的陽性結果樣本，用接種環蘸取少量液體在四種抗生素抗性固體培養基上劃線，37℃，150 r/min 恒溫培養24 h。然后將初步認為是類腸球菌的菌株利用16S rRNA 基因序列分析法鑒定細菌。

1.3.4 致病菌的革蘭氏染色 培養菌液至對數生長期（OD600=1） 時，用接菌環蘸取菌懸液均勻涂抹于干凈的載玻片上，采用經典革蘭氏染色法進行染色后鏡檢。于油鏡下觀察致病菌的菌體形態特征，確定革蘭氏染色結果。

1.3.5 致病菌的透射電鏡觀察 取新分離菌的培養液（OD600=1） 25 μL 加入50 μL 濃度為0.5%的戊二醛，取混合液滴在一枚有碳膜的銅網中間，靜止30 min，用吸水紙吸取多余液體，小心不要弄破銅網，取2%磷鎢酸滴在銅網上，室溫下對混合液進行染色2 min，后用吸水紙吸取多余染液，室溫下待銅網晾干，然后進行透射電鏡觀察。

1.3.6 16S rRNA 基因序列分析 利用細菌基因組提取試劑盒提取所有口腔臨床分離菌株的基因組DNA，嚴格遵從產品說明書的方法和步驟。

利用細菌16S rRNA 基因通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-G GTTACCTTGTTACGACTT-3'） 進行PCR 擴增。PCR 反應體系為50 μL：2 μL 因組模板、引物各1 μL，2.5 mM dNTP 4 μL、Ex-TaqDNA 聚合酶0.5 μL，10×Ex-Taqbuffer 5 μL，加滅菌蒸餾水補足至50 μL。PCR 反應程序如下：98℃變性30 s，50℃退火45 s，72℃延長90 s，以上過程循環30次。PCR 產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR 產物與pMD18-T 載體連接，并轉化糞腸球菌DH5，陽性克隆進行序列測定，最后將測序的16S rRNA 基因序列提交NCBI 數據庫，并與數據庫中的其他相關基因組序列進行比對，建立同源系統發育進化，初步確定分離物的分類地位。

1.3.7 同源系統發育進化的構建 把測序獲得的序列在NCBI 網站進行比對分析，挑選相似度高的序列，利用Mega 5.1 進行分析并構建系統發育樹。利用Neighbor-joining 方法，即N-J 法進行分析。

1.3.8E.faecalisYN771 的生物學特性研究（1）E.faecalisYN771 的生長溫度范圍：將保存在4℃糞腸球菌菌懸液作為菌種，接種到新鮮BHI 固體平板上，分別倒置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、37℃、42℃和55℃不同溫度的恒溫培養箱中，培養24 h，觀察記錄糞腸球菌生長狀況，實驗平行重復3 次。（2）E.faecalisYN771 的生長曲線：紫外分光光度儀測定生長曲線中零時讀數的OD600吸光度值，之后從60 min 開始取樣，一直觀察到310 min。每次取2 mL 測定OD600值。以培養時間為橫坐標，各時間OD600數值為縱坐標，繪制糞腸球菌的一步生長曲線。實驗平行重復3 次。（3）E.faecalisYN771 的代時測定。代時是指分裂一代所用的是時間，單位為分鐘。在最適條件（營養、pH 和溫度） 下，培養至對數期，在不同時間后計數單位體積中的細菌個數，計算細菌數目增大一倍所需要的平均時間。E.faecalisYN771 培養2 h 取出100 μL 菌懸液，梯度稀釋后做活菌計數，3.8 h 時取出100 μL 菌懸液，梯度稀釋后再次做活菌計數。實驗平行重復3 次；（4）E.faecalisYN771 的耐藥性：取對數期E.faecalis YN771 5mL送至昆明市延安醫院檢驗科進行耐藥性檢測，包含12 種抗生素，分別為：青霉素G、氨芐西林、環丙沙星、紅霉素、左氧氟沙星、替加環素、利奈唑胺、莫西沙星、萬古霉素、奎奴普丁、克林霉素、四環素。

2 結果

2.1 致病菌的鑒定結果

2.1.1 致病菌的形態觀察 經抗生素抗性平板培養，在青霉素G、氨芐西林和四環素平皿上均無細菌生長，僅在克林霉素抗性培養基上發現6 個菌落，各菌落的形態均一致，每個菌落直徑約0.5～1.0 mm，呈圓形，菌落不透明，灰白色、表面光滑。將6 個菌落分別經三次劃線純化后轉接至新的抗性平皿上均能生長，隨機挑取其中的一個單菌落接種至液體培養基中振蕩培養，待菌液處于對數生長期時，取100 μL 梯度稀釋后涂板，37℃恒溫孵育24 h 后，菌落形態見圖1A。光學顯微鏡下經革蘭氏染色的菌體形態如圖1B 所示，圓形或橢圓形，呈鏈狀排列，為G+菌。透射電鏡觀察到細菌無芽胞，無鞭毛，直徑0.9～1.1 μm（圖1C、D）。

圖1 細菌的形態Fig.1 Morphology of bacteria

2.1.2 16S rRNA 基因序列分析 PCR 成功擴增出大小約1，500 bp 的目的片段。16S rRNA 基因測序獲得長為1，466 bp 的有效片段。

2.1.3 構建致病菌的同源系統發育進化樹 同源序列比對表明：YN771 菌株與糞腸球菌的同源性最高，達到99%，將其命名為糞腸球菌YN771（Enterococcus faecalis YN771），序列提交NCBI 數據庫，GenBank 登錄號為MH919370。

以芽孢桿菌16S rRNA 基因作為外群，構建的系統發育進化樹見圖2，可以看出，YN771 菌株與糞腸球菌的相似度最高。

圖2 E.faecalis YN771 系統發育進化關系Fig.2 Phylogenetic analysis of E.faecalis YN771

2.2 E.faecalis YN771 生物學特性

E.faecalisYN771 生長溫度范圍E.faecalisYN771 生長溫度范圍結果見表1，生長溫度范圍在20～42℃，最適溫度約為37℃。

表1 E.faecalis YN771 在不同溫度下的生長情況Tab.1 Growth of E.faecalis YN771 at different temperatures

2.3 E.faecalis YN771 生長曲線

通過吸光度法測定E.faecalisYN771 的生長情況，并根據吸光度繪制了該菌的生長曲線，如圖3所示。E.faecalisYN771 的吸光度值隨著時間的延長而不斷上升。宿主菌按1%的接種量，在37℃培養箱中培養160 min 進入對數生長期，對數生長期維持時間較短，大約有80 min，培養240 min 進入到平臺期。

圖3 E.faecalis YN771 的生長曲線Fig.3 The growth curves of E.faecalis YN771

2.4 E.faecalis YN771 的代時

在最適生長條件：BHI 培養基，37℃，pH 7條件下培養，E.faecalisYN771 培養1 h 時的活菌計數為9×107cfu/mL，培養至2.8 h 的活菌計數為6×109cfu/mL。

將數值代入公式G=1/R=（t2-t1）/3.322（lgx2-lgx1） 計算，G=18 min，代時確定為18 min。

2.5 E.faecalis YN771 的耐藥性

E.faecalisYN771 耐藥性實驗結果見表2，可以看出，E.faecalis YN771 對青霉素G、氨芐西林、環丙沙星、紅霉素、左氧氟沙星、替加環素、利奈唑胺、莫西沙星、萬古霉素、四環素表現出敏感性，對奎奴普丁藥敏性不高，但對克林霉素表現耐藥性。

表2 E.faecalis YN771 耐藥性檢測Tab.2 Antibiotics-resistance of E.faecalis YN771

3 討論

糞腸球菌是根管治療后根尖周炎的主要檢出菌[8]，本實驗從臨床再治療根管中分離得到一株糞腸球菌。在平皿上觀察該菌的菌落直徑約0.5～1.0 mm，菌落不透明，灰白色、表面光滑。光學顯微鏡下觀察細菌為G+菌，圓形或橢圓形，呈鏈狀排列，透射電鏡觀察到細菌無芽胞，無鞭毛，直徑0.9～1.1 μm，完全符合糞腸球菌的形態學特點，但是鏈球菌在瓊脂培養基也可以形成圓形、表面光滑、針尖大小的菌落，這些特征與糞腸球菌很相似[9]，單憑觀察其染色特性和形態特性難于把兩者完全區分。為了進一步鑒別細菌種屬，我們通過16S rRNA 基因序列分析和構建系統發育進化樹，結果顯示再治療根管分離株與收錄的糞腸球菌序列同源性最高，綜合以上幾個方面的鑒定，確定該分離菌株為糞腸球菌，并將其命名為糞腸球菌YN771。

本實驗得出E.faecalisYN771 生長溫度范圍在20～42℃，最適溫度約為37℃，這一結果與Erika等人所報道的研究結果一致[10]，Erika 認為糞腸球菌在BHI 培養基上生長溫度為6.5～47.8℃。37℃與人體及動物的口腔內的溫度相適應，為后續動物實驗的開展提供了數據支持，研究結果也表明E.faecalis YN771 可以在動物口腔內正常生長。溫度是細菌生長的最重要影響因素，對數期的熱耐受性最弱，從穩定期開始到饑餓期，細菌表現出越來越強的熱耐受性[11-12]。糞腸球菌熱耐受性主要與兩個重要的因素有關，一是與細胞膜中脂質與脂肪酸的含量有關，越靠近細菌生長的最低溫度，細胞膜的結構越穩定[12]。隨著外界溫度的升高，膜內飽和脂肪酸含量逐漸增加，而不飽和脂肪酸含量下降，則糞腸球菌活力減弱[13]。二是與細菌的生長階段有關，到饑餓期，周圍環境營養匱乏或低溫光照的環境下達到較低的代謝水平，即進入糞腸球菌饑餓狀態或活的非可培養（viable but nonculturable，VBNC） 狀態，但仍保持良好的外膜完整性、黏附能力、侵入力、基因合成和表達能力，同時其外膜發生特異性變化。當外界環境適宜后，其繁殖能力可迅速恢復[14-15]。

E.faecalisYN771 對青霉素G 等10 中抗生素敏感，而對克林霉素具有耐藥性。由于實驗中使用的抗生素種類少，不排除其仍會對其他抗生素耐藥。該菌之所以能夠導致難治性根尖周炎的形成，除本身具有部分抗生素抗性外，一個更主要的原因是在根尖周微環境中有效形成了生物膜的結構，這方面的研究也值得關注。微生物形成的生物膜能使細菌耐藥性提高100～1 000 倍[16]。在臨床口腔治療中，根管消毒劑氫氧化鈣液pH 只有達11.5 時，才能殺死99.99%的糞腸球菌[17]，提高次氯酸鈉、氯己定、洗必泰及鉀絡合物（iodinepotassiumiodide，IKI） 的濃度也無法完全清除糞腸球菌[18-20]，仍能在預備后的根管內存活。糞腸球菌可以單獨形成生物膜，提高了細菌之間的能量交換、信號傳遞以及對惡劣環境的抵抗力量。糞腸球菌主要利用口腔食物中的碳水化合物、氨基酸、甘油、乳酸和許多酮酸等[21]產生能量。當營養匱乏、周圍環境惡劣時，生物膜中的糞腸球菌的侵襲性增加，不斷改變膜蛋白的表達，特別是表面毒力蛋白明膠酶E（Gelatinase E，GelE）、Ebp （Endocarditis and Biofilm Associated pili） R 和分選酶（Sortase，Srt）等在糞腸球菌生物膜形成過程中表達明顯增加[22-26]。細菌會自發躲避惡劣的環境，通過絲氨酸蛋白酶，明膠酶，結合膠原蛋白粘附到牙本質小管深層、分叉區、三角區、不規則區等[27]。研究證實其侵襲能力與細菌中含有的被稱為“毒力島”的DNA 片段[28]有關。

本研究從臨床再治療根管中分離得到一株致病性糞腸球菌，通過生理生化特性及分子生物學方法對其進行鑒定，為臨床治療難治性根尖周炎提供研究材料和研究基礎。