血塞通注射液質量標準中生物活性測定的方法

王 璐，劉 勤，張紅宇，劉永輝

（1） 云南省食品藥品監督檢驗研究院，云南昆明 650031；2） 昆明醫科大學第三附屬醫院，云南省腫瘤醫院藥學部，云南昆明 650118）

血塞通注射液是五加科植物三七的根莖經加工制成的三七總皂苷配制成的滅菌水溶液，是在心腦血管疾病治療中發揮重要作用的中藥注射劑，其功能主治為活血祛瘀，通脈活絡[1-2]。用于中風偏癱，淤血阻絡證。血塞通注射液的的質量標準中規定三七總皂苷的含量應為其標示量的80.0%～120.0%，且規定了三七總皂苷的指紋圖譜相似度不得低于0.95[3]，但中藥的藥材來源廣泛、多變，制備工藝復雜，而且，中藥中含有多種活性成分具有多種多樣的藥理作用，如果僅控制或檢測評價少數成分，無法綜合客觀真實地反映藥品安全、有效的相關質量問題。為保證每批藥品的有效性和安全性，有必要豐富和完善中藥的質量標準，在完成藥品含量測定的基本要求外，有必要增加藥品生物活性測定，選擇原理明確的實驗方法，選擇檢測指標應具備較強的客觀性和專屬性，應該能夠充分體現藥品的的功能主治或藥理作用[4-5]。本研究中，筆者選取了工藝穩定、質量合格的3家企業6 個批號的血塞通注射液來進行小鼠體內血栓實驗[6-7]、小鼠斷頭存活時間實驗[6]、小鼠常壓耐缺氧實驗[8]、小鼠游泳時間實驗（抗疲勞實驗）[8]，最終篩選出實驗方法應具備：簡便、低廉、合理、明確、靈敏以及重現性好的生物活性測定的實驗方法[9]。

1 材料和方法

1.1 材料

試藥與動物1 號樣品：規格2 mL:100 mg，批號20 160304；2 號樣品：規格10 mL:250 mg 批號20160302 ；A 制藥有限公司；3 號樣品：規格5 mL:250 mg 批號ZKC1501；4 號樣品：規格10 mL:400 mg 批號ZLE1501；B 制藥有限公司5 號樣品：規格5 mL:250 mg，批號15GK202-23；6 號樣品：規格5 mL:250 mg，批號15GK201-12；C 制藥有限公司。以上樣品三七總皂苷含量測定均為標示量的80%～120%。血塞通注射液最大人用劑量6.67 mg/kg。

膠原蛋白型，酷爾生物，批號：B264565，規格1 g；鹽酸腎上腺素注射液，上海和豐制藥有限公司，批號10151101，規格1 mL:1 mg；注射用鹽酸川芎嗪，合肥平光制藥有限公司，批號201509073，規格80 mg；尼莫地平注射液，揚子江藥業集團有限公司，批號16051541，規格20 mL:4 mg。

試驗動物：小鼠，昆明醫科大學實驗動物學部提供，ICR，SPF 級別，雌雄兼有，體重18～20 g，動物生產許可證號：SCXK（滇） K2015-0002。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠體內血栓實驗 取18～20g 小鼠96 只（雌雄各半），按體重隨機分為：陰性對照組、陽性對照組以及6 個批號的血塞通注射液組，共8組，每組12 只。給藥途徑為腹腔注射，給藥體積0.2 mL/10 g，連續5d 給藥，陰性對照組注射氯化鈉注射液，陽性對照組注射60 mg/kg 的注射用鹽酸川芎嗪（臨床劑量30 倍），血塞通注射液組按體重200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30 倍） 給藥。在第5d 給藥后30 min 進行尾靜脈注射含腎上腺素0.02 mg/mL 與膠原蛋白0.60 mg/mL 的混合誘導劑造成小鼠血栓模型，給藥體積0.1 mL/10 g，注射后立即觀察小鼠死亡個數以及15 min 內小鼠偏癱未恢復數，偏癱率=（死亡個數+15 min 偏癱未恢復個數）/總個數，保護率=（未偏癱個數+15 min內偏癱恢復個數）/總個數，陰性對照組的偏癱率大于等于80%說明造模成功。

1.2.2 小鼠斷頭存活時間實驗 取小鼠96 只（18～20 g、雌雄各半），按體重隨機分為陰性對照組、陽性對照組以及6 個批號的血塞通注射液組，共8 組，每組12 只，給藥途徑為腹腔注射，給藥體積均為0.2 mL/10 g。陰性對照組給予氯化鈉注射液，血塞通注射液組按200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30 倍） 給藥，連續5 d。陽性對照組給予1.65 mg/kg 的尼莫地平注射液（臨床劑量25 倍），僅第5 天給藥。于第5 天給藥30 min 后，用大剪刀在小鼠耳下部位快速斷頭，記錄小鼠斷頭后張口喘息停止時間。

1.2.3 小鼠常壓耐缺氧實驗 取18～20g 小鼠96只（雌雄各半），按體重隨機分為陰性對照組、陽性對照組以及6 個批號的血塞通注射液組，共8組，每組12 只，給藥途徑為腹腔注射，給藥體積均為0.2 mL/10 g。陰性對照組給予氯化鈉注射液，血塞通注射液組按200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30倍） 給藥，連續5 d。陽性對照組給予1.65 mg/kg的尼莫地平注射液（臨床劑量25 倍），僅第5 d 給藥。第5 d 給藥30 min 后，將小鼠放入盛有15 g鈉石灰的廣口瓶內（每瓶放1 只小鼠），用凡士林涂抹瓶口并蓋嚴，使之不漏氣，開始計時，以呼吸停止為指標，觀察小鼠因缺氧而死亡的時間。

1.2.4 小鼠游泳時間實驗（抗疲勞實驗） 取小鼠96 只（雌雄各半，標準體重），按體重隨機分為陰性對照組、陽性對照組以及6 個批號的血塞通注射液組，共8 組，每組12 只，給藥途徑為腹腔注射，給藥體積均為0.2 mL/10 g。陰性對照組給予氯化鈉注射液，血塞通注射液組按200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30 倍） 給藥，連續5d。陽性對照組給予1.65 mg/kg 的尼莫地平注射液（臨床劑量25倍），僅第5 d 給藥。在塑料大桶內加水，水深30 cm，水溫保持在（27±0.5） ℃，各組動物均于第5 天給藥30 min 后，在尾部束一負重物（負重物為8%體重），將小鼠分別放入塑料桶內游泳，開始計時，注意觀察，當小鼠頭部沉入水中10秒不能浮出水面者即為體力耗竭，即刻計時為小鼠游泳時間。

1.3 統計學處理

用SPSS 軟件做統計分析進行統計。小鼠體內血栓實驗以動物是否死亡計數，采用卡方檢驗進行統計。小鼠：斷頭存活時間實驗、常壓耐缺氧實驗、游泳時間實驗（抗疲勞實驗） 的結果均采用均數標準差（） 表示，組間t檢驗，

2 結果

2.1 小鼠體內血栓實驗結果

陽性對照組注射用鹽酸川芎嗪及4 個批號的血塞通注射液與陰性對照組比較，未偏癱個數與15min 內偏癱恢復的數量增加，并且統計學具有顯著性差異，表明所檢測藥品對混合誘導劑誘導的急性血栓有顯著的保護作用。2 個批號的血塞通注射液與陰性對照組進行比較小鼠的未偏癱個數和偏癱后恢復個數增多，但統計結果差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 血塞通注射液對小鼠體內血栓的藥效學實驗結果比較［（），n=12］Tab.1 The effects of Xuesaitong injection on mouse thrombosis ［（），n=12］

表1 血塞通注射液對小鼠體內血栓的藥效學實驗結果比較［（），n=12］Tab.1 The effects of Xuesaitong injection on mouse thrombosis ［（），n=12］

與陰性組比較，#P＜0.05。

2.2 小鼠斷頭存活時間實驗結果

陽性對照組尼莫地平注射液及5 個批號血塞通注射液與陰性對照組比較喘息的時間明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05），其中1 個批號的血塞通注射液與與陰性對照組比較喘息的時間明顯延長，統計學結果差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 血塞通注射液小鼠斷頭存活時間實驗結果比較［（），n=12］Tab.2 The effects of Xuesaitong injection on mouse decapitation survival experiment ［（），n=12］

表2 血塞通注射液小鼠斷頭存活時間實驗結果比較［（），n=12］Tab.2 The effects of Xuesaitong injection on mouse decapitation survival experiment ［（），n=12］

與陰性組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.3 小鼠常壓耐缺氧實驗結果

陽性對照組尼莫地平注射液與陰性對照組比較喘息的時間有明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05）；4 個批號的血塞通注射液與與陰性對照組比較喘息的時間有明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05）；2 個批號的血塞通注射液與與陰性對照組比較喘息時間延長，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 血塞通注射液常壓耐缺氧作用的藥效學研究［（），n=12］Tab.3 The effects of Xuesaitong injection on atmospheric anoxia experiment ［（），n=12］

表3 血塞通注射液常壓耐缺氧作用的藥效學研究［（），n=12］Tab.3 The effects of Xuesaitong injection on atmospheric anoxia experiment ［（），n=12］

與陰性組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.4 小鼠游泳時間實驗結果

陽性對照組尼莫地平注射液與陰性對照組進行比較游泳的時間有所延長，差異無統計學意義（P＞0.05）；3 個批號血塞通注射液與與陰性對照組比較游泳時間的明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05）；3 個批號的血塞通注射液與與陰性對照組比較游泳的有時間延長，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 血塞通注射液小鼠游泳時間實驗（抗疲勞實驗） 的藥效學實驗結果比較［（），n=12］Tab.4 The effects of Xuesaitong injection on swimming time［（），n=12］

表4 血塞通注射液小鼠游泳時間實驗（抗疲勞實驗） 的藥效學實驗結果比較［（），n=12］Tab.4 The effects of Xuesaitong injection on swimming time［（），n=12］

與陰性組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 討論

3.1 在中藥質量標準中增加生物活性測定項的必要性

本研究表明，雖然6 批血塞通注射液中三七總皂苷含量均符合目前質量標準規定，但生物活性測定結果有所不同，由于不同企業的生產工藝或同一企業不同的原料（產地） 等因素的存在，導致血塞通注射液有效性存在明顯的不同，目前，中藥注射液存在活性成分不明，工藝可變因素多等許多問題，脫離了生物活性的成分的理化分析并不能全面地控制其質量和充分反映其臨床療效，結合“生物活性測定”方法進行藥品的綜合評價才能更好地反映其質量和療效[10]。

3.2 分析結果和比較方法

本試驗嚴格按照《中國藥典》2015 年版四部附錄“中藥生物活性測定指導原則”[9]進行設計，建立的生物活性測定方法符合隨機、對照、重復藥理學研究的基本原則，選擇的檢測指標應客觀、專屬性強，與該品種的功能主治密切相關[11]。研究中，筆者選用了工藝穩定、質量合格且市場占有率較高的3 家企業生產的血塞通注射液共4 個規格6 個批號的樣品，根據其主要藥效學為活血化瘀抗缺氧耐疲勞，我們將生物活性測定方法集中在四個方法，即小鼠體內血栓實驗、小鼠斷頭存活時間實驗、小鼠常壓耐缺氧實驗、小鼠游泳時間實驗（抗疲勞實驗） 反復篩選。

在四個藥效學實驗中，對各實驗測定方法影響因素進行考察，其中小鼠斷頭存活的實驗結果與臨床有較大差異，而且，不同廠家的產品檢測結果比較接近，敏感性較差，特別是在質量僅有微小差異的情況下更不適用。小鼠游泳時間實驗（抗疲勞實驗） 方法簡單易行，但是實驗中小鼠游泳時水溫對小鼠是非疲勞性刺激，水溫不能保持恒定或者溫度過高過低均會影響實驗結果，另外動物本身個體差異也會導致游泳時間差別較大，本實驗誤差較大。小鼠體內血栓實驗及小鼠常壓耐缺氧實驗受人為因素干擾較小且較敏感，實驗周期短，指標明確，操作方法簡單易行，平行性好，不需要復雜儀器。小鼠體內血栓實驗以死亡與否為計數數據，采用χ2檢驗進行統計，統計方法簡單成熟，小鼠常壓耐缺氧實驗統計采用組間t檢驗，方法簡單，誤差控制限值較低。另外“生物活性測定”如果要正式收載于質量標準中，還必須考慮一些實驗條件應選擇：背景資料清楚、影響因素少、成本低廉和檢測指標靈敏度高的試驗系統；應盡可能選擇小鼠和大鼠等來源廣成本低的實驗動物，并且符合“3R”減少和替代的原則[10]。以本實驗結果以及評價指標為基礎，初步建立適宜于血塞通注射液生物活性的測定方法：小鼠體內血栓形成實驗和小鼠常壓耐缺氧實驗。

3.3 建立生物活性檢定方法

血塞通注射液在臨床廣泛用于冠心病心絞痛腦梗死等急重癥病患，屬于急重癥用藥，應該能保證每個批次的產品具有可靠的生物活性，因此，應當在血塞通注射液質量標準中增加“生物活性測定”更好地綜合評價其質量。嚴格按照《中國藥典》指導原則，生物活性測定建議采用：初試和復試結合評價測定結果。初步擬定標準為：實驗一取小鼠96 只，體重18～20 g，每次實驗隨機分為陽性對照組、陰性對照組和血塞通注射液組，每組10 只，給藥途徑為腹腔注射，給藥體積0.2 mL/10 g，連續注射5 d，陰性對照組注射氯化鈉注射液，陽性對照組注射60 mg/kg 的注射用鹽酸川芎嗪（臨床劑量30 倍），血塞通注射液組按200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30 倍） 給藥。在第5 天給藥30 min 后進行小鼠尾靜脈注射含腎上腺素0.02 mg/mL 與膠原蛋白0.60 mg/mL 的混合誘導劑造成小鼠血栓模型，給藥體積0.1 mL/10 g，注射后立即觀察小鼠死亡個數以及15 min 內小鼠偏癱未恢復數量，偏癱率=（死亡個數+15 min 偏癱未恢復個數）/總個數，保護率=（未偏癱個數+15 min內偏癱恢復個數）/總個數，陰性對照組的偏癱率大于等于80%說明模型成功。對數據進行統計學組間t檢驗處理。結果判斷：陽性對照組鹽酸川芎嗪作用與陰性對照組進行比較，小鼠未偏癱數與小鼠偏癱恢復個數增多，并且統計學結果有顯著性差異時，實驗成立。給藥組與陰性對照組比較，小鼠未偏癱個數與小鼠偏癱恢復數增多，統計學結果有顯著性差異時應判為符合規定。如給藥組與陰性對照組比較，統計結果沒有顯著性差異，應復試。復試時每組小鼠為15 只，其余條件同上，復試的統計學結果具有顯著性差異，判定應為符合規定，否則為不符合規定。

實驗二取體重18～20 g 小鼠96 只，每次實驗隨機分成陰性對照組、陽性對照組血塞通組，每組10 只，給藥途徑為腹腔注射，給藥體積均為0.2 mL/10 g。陰性對照組給予氯化鈉注射液，血塞通注射液組按200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30 倍）給藥，連續5 d。陽性對照組給予1.65 mg/kg 的尼莫地平注射液（臨床劑量25 倍），僅第5 d 給藥。第5 天給藥30 min 后，將小鼠放入盛有15 g 鈉石灰的廣口瓶內（每瓶放1 只小鼠），用凡士林涂抹瓶口蓋嚴，使之不漏氣，開始計時，以呼吸停止為指標，觀察小鼠因缺氧而死亡的時間。結果判斷：陽性對照組作用與陰性對照組比較，小鼠喘息時間明顯延長，用組間t檢驗統計，當統計結果有顯著性差異時，實驗成立。給藥組與陰性對照組進行比較，小鼠喘息的時間應明顯延長，并且實驗結果統計學具有顯著性差異時判為符合規定。如給藥組與陰性對照組比較，統計結果沒有顯著性差異，應復試。復試時每組小鼠數量為15 只，其余條件同上，復試的結果有統計學意義，判定為符合規定，否則為不符合規定。