七氟烷對人骨肉瘤Saos2 細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響

李珊珊，全宇航，龔玲俐，楊 會，浦勁宏，王忠慧

（昆明醫科大學第三附屬醫院麻醉手術科，云南昆明 650118）

骨肉瘤（ostesarcoma，OS） 是青少年中第三常見的癌癥，15 歲以下兒童的年發病率為5.6/100萬[1]。微小殘留疾病的存在，可導致大面積手術切除后癌癥復發轉移，是癌癥患者死亡的首要原因。這些殘留癌細胞的進展取決于圍手術期多種協同的因素，其中包括麻醉技術及藥物對腫瘤復發轉移的影響。七氟烷對骨肉瘤的作用尚未闡明。筆者旨在探討七氟烷對骨肉瘤Saos2 細胞的影響，以盡可能減少麻醉相關的腫瘤復發轉移。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤細胞株（Saos2 細胞）：購自昆明江宗生物科技有限公司，由中國醫學科學院醫學生物學研究所分子生物室提供。胎牛血清：購自BIOSHARP 公司，RPMI1640 培養基、cck-8 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。七氟烷購自江蘇恒瑞醫藥有限公司。劃痕實驗采用ibidi 傷口愈合與細胞遷移插件。

1.2 細胞培養方法與分組

向人骨肉瘤Saos2 細胞中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基，置于37℃、5%CO2培養箱，取出處于對數期生長的Saos2 細胞，配制成1×106cell/mL 細胞懸液，接種于細胞培養板中，分別標記為對照組（Control 組）、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組。將要處理的Saos2 細胞放置于特制無菌密閉容器中，密閉容器進氣口與七氟烷麻醉機連接，出氣口與氣體分析儀連接；對照組以相同流量的無菌過濾氧氣處理。每組處理相同時間各2 h，七氟烷處理完畢后，于密閉容器中取出細胞繼續培養24 h，以供進行增殖、侵襲、遷移及凋亡能力的測定。

1.3 細胞增殖率檢測

采用cck-8 法。0.25%胰酶消化收集細胞，接種至96 孔板內，每孔接種2500 個細胞，空白孔內只加入培養基和cck-8 溶液。過夜培養后按照實驗分組做對應處理。處理結束后24 h 每孔加入10 μL cck-8 試劑，培養箱內孵育2 h 后酶標儀450nm 波長下檢測吸光度（OD 值）。

1.4 細胞侵襲能力觀察

采用Transwell 小室實驗。在上下室之間鋪上適宜濃度的基質膠。取對數期生長的Saos2 細胞，進行消化、離心配制成細胞懸液，調整細胞密度為1×105cell/mL，每孔上室加入細胞懸液100 μL，下室加入500 μL 含FBS 培養液，接種后不同濃度七氟烷作用2 h 后培養箱內培養24 h。經固定、染色、清洗后100 倍鏡下觀察拍照。每個小室隨機選取5 個視野，拍照并計數細胞數量。

1.5 劃痕傷口愈合實驗

0.25 %胰酶消化收集細胞，調整懸液濃度為2.5×104/mL，往ibidi 插件的左右孔中各加入100 μL 的細胞懸液。培養箱內培養至融合度達到90%～100%，小心的用鑷子將傷口愈合插件拔出，用基礎培養基清洗一次細胞，加入MEM 基礎培養基，不同濃度七氟烷作用2 h 后培養箱內培養，于0 h、12 h 觀察傷口愈合情況。采用ImageJ 圖片分析軟件計算劃痕愈合率。

1.6 細胞凋亡實驗

0.25 %胰酶消化收集細胞，接種至6 孔板內，每孔接種105個細胞。當細胞融合度達到70%左右時更換為MEM基礎培養基，不同濃度七氟烷作用2 h，培養箱內培養24 h 后，用0.25 胰酶消化收集細胞，PBS 清洗兩次。用100 μL 流式凋亡結合緩沖液重懸細胞，每管加入5 μL Annexin V 混勻，室溫避光孵育10 min。隨后每管加入5 μL PI 避光孵育5 min，用PBS 將液體補至1 mL 后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 統計學處理

采用Graph pad8.0 統計軟件處理數據。計量資料服從正態分布以均數±標準差描述，組間比較采用單因素方差分析，有差異用Dunnettt檢驗與對照組比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 cck-8 細胞增殖率檢測結果

對照組和1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組的細胞增殖率分別為 100%、91.72%±2.23%、86.36% ±2.56%、81.97% ±3.71%，七氟烷組細胞增殖率均低于對照組（P＜0.05）），且隨著七氟烷濃度的增加，抑制增殖作用增強，見圖1。

2.2 Transwell 小室細胞侵襲能力的比較

對照組和1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組穿膜細胞數分別為（105.6±13.0）、（68.4±15.8）、（59.2±7.8）、（36.1±6.7）個。七氟烷組穿膜細胞數較對照組均減少（P＜0.05），表明隨著濃度的增加，七氟烷抑制侵襲作用增強，見圖2～3。

圖1 各組Saos2 細胞增殖率的比較Fig.1 Comparison of the ratio proliferation of Saos2 cells among different groups

圖2 各組Saos2 細胞侵襲能力的比較Fig.2 Comparison of the invasion of Saos2 cells among different groups

圖3 各組Saos2 細胞侵襲能力的比較（×100）Fig.3 Comparison of the invasion of of Saos2 cells among different groups （×100）

2.3 劃痕傷口愈合實驗結果

對照組和1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組劃痕愈合率分別為86.27%±4.56%、59.71% ±2.34%、56.10% ±2.81%、23.42% ±7.13%。七氟烷組劃痕愈合率低于對照組，尤其以5.1%七氟烷組愈合率降低最為明顯（P＜0.05），見圖4、圖5。

2.4 各組細胞凋亡結果比較

對照組和1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組凋亡率分別為2.47% ± 0.56%、12.71% ±1.34%、17.50% ± 2.81%、25.42% ±3.13%。七氟烷組凋亡率均明顯高于對照組，尤其以5.1%七氟烷組凋亡最為明顯（P＜0.05）。見圖6、圖7。

3 討論

圖4 各組Saos2 細胞劃痕傷口愈合率的比較Fig.4 Comparison of the ratio of wound healing of Saos2 cells among different groups

骨肉瘤（osteosarcoma，OS） 是骨組織最常見的原發性惡性腫瘤，惡性度高，青少年多發。目前骨肉瘤的治療仍以新輔助化療和手術治療為主，5 a 生存率仍無明顯提高。隨著腫瘤學和麻醉學的研究進展，人們越來越關注麻醉藥物及方式的選擇對腫瘤患者預后的影響。吸入麻醉藥七氟烷具有效能強、可控性好的特點，是目前臨床常用的全身麻醉藥。七氟烷除了全身麻醉作用外，還可以通過降低缺血再灌注損傷、減輕炎癥反應，降低毛細血管通透性等起到多器官保護作用。研究顯示[2]，吸入麻醉藥物可以影響細胞的轉錄，也可以通過作用于多種受體、離子通道及神經遞質發揮作用。

圖5 各組Saos2 細胞劃痕傷口愈合率的比較（×100）Fig.5 Comparison of the ratio of wound healing of Saos2 cells among different groups （×100）

圖6 各組Saos2 細胞凋亡率比較Fig.6 Comparison of the ratio of apoptosis of Saos2 cells among different groups

圖7 各組Saos2 細胞凋亡率比較Fig.7 Comparison of the ratio of apoptosis of Saos2 cells among different groups

越來越多的證據表明，七氟烷可以直接作用于腫瘤細胞，與腫瘤復發轉移有關。其可能機制主要包括血小板活化、誘導凋亡小體產生以及Ras/ERK、TGF/smad3 和PI3K/AKT 等信號通路的激活等。以往的研宄顯示，七氟烷可能通過降低XIAP、suvivin 基因的表達及激活caspase-3 基因而抑制肺癌A549 細胞增殖，誘導細胞凋亡[3]。七氟烷還能夠抑制喉癌HEP-2 細胞和結腸癌sw620 細胞及HCT1116 細胞的增殖[4-6]。最新研究發現低濃度七氟烷可促進原發性犬乳腺癌細胞的增殖能力，但對于轉移性的乳腺癌細胞表現為劑量濃度依賴性的抑制作用，認為與七氟烷調控NET1 基因有關[7]。但在乳腺癌的臨床研究中七氟烷麻醉的患者并未表現出較差的預后[8]。七氟烷呈劑量依賴性的抑制慢性白血病干細胞/祖細胞的增殖能力，其機制是通過劑量依賴性的抑制Wnt/β-catenin 信通通路中b連環蛋白和c-myc 的表達[9]。另一研究表明七氟烷通過缺氧誘導因子促進腦膠質瘤干細胞在體外生長，可以增強卵巢癌和腎癌細胞的增殖能力[10]。最新研究表明吸入七氟醚可抑制卵清蛋白（OVA）誘導的小鼠慢性氣道炎癥，同時抑制氣道增厚，抑制杯狀細胞、平滑肌增生，抑制膠原沉積和纖維增生，從而減輕小鼠肺組織的氣道重塑[11]。

大量研究表明，七氟烷對腫瘤細胞的作用有細胞屬性，與七氟烷作用時間、濃度有關聯的。七氟烷臨床常用濃度為1%～5.1%。本研究結果顯示，低中高不同濃度七氟烷組細胞增殖率、穿膜細胞數以及傷口愈合率均低于對照組，以5.1%七氟烷組降低最為明顯，3.4%七氟烷組次之。表明不同濃度的七氟烷均能夠抑制Saos2 細胞增殖，侵襲及遷移能力，且濃度越高，作用越明顯。筆者在細胞凋亡實驗中發現不同濃度七氟烷對骨肉瘤Saos2 細胞的作用表現為促進凋亡，且與濃度呈正相關。但畢竟是體外細胞實驗與臨床實際尚有很大的差距，七氟烷對骨肉瘤患者的影響以及術后長期預后、麻醉相關的腫瘤復發轉移等作用仍需進一步的體內實驗證實。