改良單疊氮丙啶-熒光定量PCR法的建立及其檢測(cè)抗結(jié)核藥物活性的價(jià)值

張靜 陳曦 王彬 付雷 陸宇 陳效友

結(jié)核病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病，2019年WHO[1]報(bào)告估算2018年全球約1000萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病患者，全球平均結(jié)核病發(fā)病率為130/10萬(wàn)，因結(jié)核病而死亡患者約為145.1萬(wàn)例，耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的治愈率約為56%。面對(duì)嚴(yán)重的結(jié)核病疫情，亟需發(fā)現(xiàn)新的有效抗結(jié)核藥物。體外抗結(jié)核藥物活性測(cè)定是新藥藥效學(xué)評(píng)價(jià)的重要環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法[2]，耗時(shí)長(zhǎng)，現(xiàn)已較少應(yīng)用；而目前國(guó)內(nèi)外常用快速檢測(cè)最低抑菌濃度(MIC)的方法包括微孔板Alarmar blue(MABA)法[3]、刃天青微孔板稀釋(REMA)法和四唑染料 (tetrazolium dye)法等；因結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，上述檢測(cè)方法需要7～9 d才能獲得結(jié)果。因此，需要建立一種快速、有效的藥物活性檢測(cè)方法，以滿足抗結(jié)核新藥開發(fā)的需要。

單疊氮乙醚(ethidium monoazide, EMA)或單疊氮丙啶(propidium monoazide, PMA；本研究使用PMA改良類似物PMAxx)[4]是一種核酸染料，它可以通過(guò)受損的細(xì)胞膜，在暴露于強(qiáng)可見光后共價(jià)插入細(xì)菌基因組，形成不可逆結(jié)合而干擾DNA擴(kuò)增；利用EMA/PMA對(duì)受損與未受損的細(xì)菌進(jìn)行預(yù)處理并聯(lián)合熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)，根據(jù)被降低或完全抑制的PCR信號(hào)來(lái)有效鑒別活菌和死菌。盡管PMA特異性滲透及抑制DNA擴(kuò)增的機(jī)制尚不明確，但該方法已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)食品或復(fù)雜環(huán)境條件下的活菌[4]、寄生蟲[5]，以及相關(guān)的水質(zhì)鑒定[6]。但是，該方法針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究相對(duì)較少，尚未見到直接應(yīng)用于抗結(jié)核藥物活性檢測(cè)的報(bào)道。

本研究首先通過(guò)未經(jīng)處理和熱滅活的結(jié)核分枝桿菌來(lái)建立PMAxx-qPCR的檢測(cè)方法，并將該方法直接應(yīng)用于一線抗結(jié)核藥物異煙肼(INH)和利福平(RFP)體外活性測(cè)定，并且與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比較，以有效評(píng)估PMAxx-qPCR方法的適用性。

資料和方法

一、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株

結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)為北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室保存菌。

二、主要試劑和儀器

1.試劑：PMAxx(40069，美國(guó)Biotium公司)；Middle brook 7H9培養(yǎng)基(271310，美國(guó)BD公司)；Middle brook 7H10培養(yǎng)基(262710，美國(guó)BD公司)；Middle brook OADC增菌液(由氯化鈉、牛血清白蛋白、葡萄糖、過(guò)氧化氫酶、油酸組成)(212351，美國(guó)BD公司)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(P1022，北京索萊寶科技有限公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(219605580，美國(guó)Mp Bio公司)；Flash Hot Start Master Mix (SJ22e06351081，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；Eva-Green qPCR Master Mix(31000，美國(guó)Biotium 公司)；吐溫80(9005-65-6，北京索萊寶科技有限公司)；西班牙瓊脂糖(9012-36-6，北京索萊寶科技有限公司)。

2.儀器：多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)：Infinite M200pro, 瑞士迪肯公司)；電熱水浴鍋(型號(hào)：WBK-3B，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；PMA-Lite LED光解儀(型號(hào)：E90002，美國(guó)Biotium公司)；熒光定量PCR儀(StepOnePlus, 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司); PCR儀(型號(hào)：Genepro，杭州博日科技有限公司)；高速離心機(jī)(型號(hào)：1730R，中國(guó)香港基因有限公司)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

(一)菌液制備

1.標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)：結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于含10% OADC和0.05% 吐溫 80的7H9 液體培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，于酶標(biāo)儀中在570 nm處測(cè)定吸光度值(A值)[7]，以A值0.1=1×108菌落形成單位(CFU)/ml為標(biāo)準(zhǔn)，配制成終濃度為1×108CFU/ml的活菌懸液，備用。

2.熱滅活菌：取500 μl活菌(濃度：1×108CFU/ml)懸液于水浴鍋進(jìn)行熱處理(100 ℃，30 min)，冷卻至室溫，制成熱滅活菌，備用。

(二)PMAxx處理?xiàng)l件優(yōu)化

1.條件設(shè)置：曝光時(shí)間為10、15、20和30 min；暗孵育時(shí)間為10、30和60 min；PMAxx終濃度為5、10、20、40、80和100 μmol/L。

2.處理流程：將PMAxx(濃度分別為：5、10、20、40、80和100 μmol/L)分別加入含500 μl活菌或熱滅活菌(終濃度：107CFU/ml)的透光離心管中，37 ℃恒溫箱內(nèi)避光孵育(時(shí)間分別為：10、30和60 min)，室溫下于PMA-Lite LED光解儀(波長(zhǎng)λ=465～475 nm，60 W)中進(jìn)行曝光(時(shí)間分別為：10、15、20和30 min)，混懸液經(jīng)25 000×g離心5 min，后經(jīng)PBS洗滌2次，棄去上清液，取沉淀重懸于200 μl 雙蒸水(ddH2O)中。

3.DNA模板制備：將重懸液于沸水中水浴加熱30 min，15 520×g離心3 min，取上清液作DNA模板，備用。

4.qPCR檢測(cè)：反應(yīng)體系為10 μl 2×Eva-Green qPCR Master Mix、2 μl ROX校正染料(10 mg/ml)、0.5 μl 40×模板緩沖體系、rrs4正反向引物各0.3 μl(表1)、1 μl DNA模板和5.9 μl ddH2O。反應(yīng)程序(2步法qPCR[8])為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火及延伸30 s(采集熒光信號(hào))；每次PCR反應(yīng)重復(fù)40個(gè)循環(huán)進(jìn)行。記錄循環(huán)閾值(quantification cycle, Cq值)。

(三)PMAxx處理的相關(guān)影響因素

1.標(biāo)識(shí)靶基因片段長(zhǎng)度的影響: 基于NCBI中提供的結(jié)核分枝桿菌16S rRNA基因序列，利用Primer Express 3.0.1軟件自行設(shè)計(jì)PCR的引物(rrs1～3和rrs5～7)，其中rrs4引物序列引自相關(guān)的參考文獻(xiàn)[9]。并對(duì)基因庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST搜索，以評(píng)估所有引物的特異性，引物具體信息見表1，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

常規(guī)PCR反應(yīng)體系：5 μl DNA模板、25 μl的2×Flash Hot Start Master Mix和正反向引物各2.5 μl，并使用 ddH2O配平終體系至50 μl。反應(yīng)條件為95 ℃持續(xù)3 min預(yù)變性，95 ℃ 30 s變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 10 s延伸，共30個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)72 ℃延伸 10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，比較進(jìn)行和未進(jìn)行PMAxx預(yù)處理的細(xì)菌樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的差異。

2. 結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)周期：取同株等濃度的H37Rv活菌懸液分別培養(yǎng)2、3和4周。PMAxx處理組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，以未進(jìn)行PMAxx預(yù)處理的細(xì)菌樣本為對(duì)照組。兩組分別進(jìn)行qPCR檢測(cè)，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間Cq值差異。

(四)抗結(jié)核藥物活性檢測(cè)

1.抗菌藥物：選用常見的一線抗結(jié)核藥物INH(批號(hào)：#MKBV9475V)和RFP(批號(hào)：#BCBP4553V)，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；INH使用ddH2O溶解(儲(chǔ)備液濃度：1 mg/ml)，RFP使用DMSO溶解(儲(chǔ)備液濃度：1 mg/ml)，-20 ℃保存，備用。

表1 不同長(zhǎng)度標(biāo)識(shí)靶基因片段引物設(shè)計(jì)

注F=forward(正向)；R=reverse(反向)

2.抗結(jié)核藥物活性測(cè)定：具體介紹如下。

1)采用PMAxx-qPCR法測(cè)算MIC：分別取INH、RFP藥物儲(chǔ)備液經(jīng)2倍系列稀釋至合適濃度(0.003125、0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2和0.4 μg/ml)，分別加入200 μl標(biāo)準(zhǔn)株菌液(終濃度為107CFU/ml)，在含5% CO237 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，分別與INH、RFP作用3、5、7和10 d后取混懸液樣本應(yīng)用優(yōu)化后的PMAxx-qPCR方法檢測(cè)。計(jì)算抑菌活性公式：抑菌活性=(1-2-ΔCq)×100%，ΔCq=Cq含藥-Cq不含藥(每次計(jì)算對(duì)應(yīng)3個(gè)獨(dú)立樣本的DNA提取和qPCR擴(kuò)增)。繪制量效曲線[藥物濃度(μg/ml)/抑菌活性(%)]，加權(quán)法計(jì)算藥物MIC。

2) MABA法檢測(cè)藥物MIC：(1)將96孔酶標(biāo)板首行的1～6孔設(shè)置為7H9培養(yǎng)基對(duì)照(200 μl/孔)，7～12孔設(shè)為菌對(duì)照孔[(100 μl 7H9液體培養(yǎng)基+100 μl菌液)/孔]。(2)在其他行的首孔分別加入200 μl含有單藥的7H9培養(yǎng)基混合液(INH、RFP)，均經(jīng)2倍梯度稀釋至如下濃度：0.019、0.039、0.078、0.1562、0.3125、0.625、1.25、2.5、5和 10 μg/ml，在除對(duì)照孔之外的各孔中加入100 μl H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株菌液(濃度：106CFU/ml)。(3)在含5% CO237 ℃恒溫箱中孵育，7 d后向各孔加入20 μl Alamar blue和12.5 μl 20%吐溫80的混合液，再置回37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育。(4)24 h后將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)為530 nm且發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm條件下，測(cè)定各孔的相對(duì)熒光強(qiáng)度值，并計(jì)算MIC。

3) PMAxx-qPCR法測(cè)算藥物抗菌計(jì)數(shù)：將500 μl 標(biāo)準(zhǔn)株菌液(終濃度為107CFU/ml)與一定量的INH、RFP混合，各藥物終濃度設(shè)定：16×MIC，8×MIC，4×MIC，2×MIC，1×MIC(MIC單位為μg/ml)，以不含藥空白孔為陰性對(duì)照孔，于含5% CO237 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)10 d，PMAxx-qPCR檢測(cè)方法同前。取1×108CFU/ml結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)液進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，獲得108CFU/ml至102CFU/ml 7個(gè)濃度梯度，經(jīng)PMAxx預(yù)處理后提取DNA，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以ddH2O為陰性對(duì)照，確定PMAxx-qPCR方法檢測(cè)敏感度。經(jīng)線性回歸獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式[Cq值/(lg CFU/ml)]，藥物抗菌計(jì)數(shù)為含或不含藥條件下lg CFU/ml差值，并將該結(jié)果與同條件下CFU計(jì)數(shù)方法結(jié)果相比較。

4)CFU計(jì)數(shù)：菌液藥物濃度設(shè)置同前，吸取200 μl藥物作用10 d后混懸液用生理鹽水進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，均勻涂抹在7H10固態(tài)培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育3～4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、 PMAxx處理的優(yōu)化條件

1. PMAxx曝光時(shí)間：使用PMAxx對(duì)活菌進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，與對(duì)照組(未經(jīng)PMAxx處理)比較，曝光10、15和20 min時(shí)Cq值無(wú)明顯變化，而曝光30 min 時(shí)Cq值明顯升高(q=8.975，P<0.05)(表2)，提示曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可抑制活菌的擴(kuò)增；使用PMAxx對(duì)等量熱滅活菌預(yù)處理時(shí)，各處理組較對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示使用PMAxx處理可抑制熱滅活菌的擴(kuò)增，但曝光10 min時(shí)，熱滅活菌Cq值小于其他時(shí)間組(P值均<0.05)，提示曝光10 min混懸液中仍存在未與PMAxx結(jié)合的游離DNA引起擴(kuò)增，而曝光15、20和30 min時(shí)，各組間Cq值不再隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生變化(P值均>0.05)(表2)。綜合死菌和活菌的結(jié)果，以不影響活菌擴(kuò)增且充分反映死菌的差異為原則，選擇15 min作為最佳曝光時(shí)間。

2. PMAxx暗孵育時(shí)間： PMAxx預(yù)處理活菌暗孵育10和30 min與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而暗孵育60 min后Cq值出現(xiàn)輕度升高(q=3.991，P=0.006)；同時(shí)，經(jīng)PMAxx處理的熱滅活菌各組檢測(cè)的Cq值較對(duì)照組結(jié)果明顯升高(P<0.001)，且各時(shí)間組間兩兩比較，Cq值不隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生變化(P值均>0.05)，提示10 min即可滿足PMAxx預(yù)處理孵育要求(表3)。

3. PMAxx最適濃度：PMAxx濃度對(duì)活菌和熱滅活菌qPCR檢測(cè)的影響如圖1所示，隨著PMAxx處理濃度的增加，活菌懸液Cq值總體上有升高趨勢(shì)，以未經(jīng)PMAxx預(yù)處理菌樣本為陰性對(duì)照，當(dāng)PMAxx濃度升高至80 μmol/L 及以上時(shí)，活菌擴(kuò)增Cq值明顯增大(26.844±0.376 與 31.625±0.890，t=12.300，P<0.001)，說(shuō)明高濃度的PMAxx將抑制活菌DNA擴(kuò)增，且濃度越高抑制效果越明顯，因此，不影響活菌擴(kuò)增的適宜濃度范圍為5～40 μmol/L。當(dāng)PMAxx濃度為5 μmol/L時(shí)，PMAxx處理的熱滅活菌較陰性對(duì)照Cq值無(wú)明顯變化(27.767±0.244與26.830±0.123，t=2.410，P=0.387)，說(shuō)明該濃度下無(wú)法抑制樣品中DNA的擴(kuò)增；當(dāng)PMAxx濃度≥10 μmol/L時(shí)，Cq值明顯升高且各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

表2 曝光時(shí)間對(duì)PMAxx-qPCR方法鑒定活菌和熱滅活菌的影響

注Cq值：循環(huán)閾值。各項(xiàng)數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析的Tukey多重檢驗(yàn)。a: 對(duì)照組與曝光10 min的比較；b: 對(duì)照組與曝光15 min的比較;c: 對(duì)照組與曝光20 min的比較；d：對(duì)照組與曝光30 min的比較;e: 曝光10 min與曝光15 min的比較;f: 曝光10 min與曝光20 min的比較;g: 曝光10 min 與曝光30 min的比較:h: 曝光15 min與曝光20 min的比較;i: 曝光15 min與曝光30 min的比較；j: 曝光20 min與曝光30 min的比較；“-”：空白

表3 暗孵育時(shí)間對(duì)PMAxx-qPCR方法鑒定活菌和熱滅活菌的影響

注Cq值：循環(huán)閾值。各項(xiàng)數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析的Tukey多重檢驗(yàn)。a: 對(duì)照組與暗孵育10 min的比較；b: 對(duì)照組與暗孵育30 min的比較;c: 對(duì)照組與暗孵育60 min的比較；d：暗孵育10 min與暗孵育30 min的比較;e：暗孵育10 min與暗孵育60 min的比較;f：暗孵育10 min 與暗孵育60 min的比較。“-”：空白

Cq值：循環(huán)閾值；“┰”表示標(biāo)準(zhǔn)差圖1 不同PMAxx濃度對(duì)活菌和熱滅活菌qPCR檢測(cè)的影響

“-”表示未經(jīng)PMAxx預(yù)處理，“+”表示經(jīng)PMAxx預(yù)處理。M：Marker(2000 bp)；標(biāo)記編號(hào)1～7分別代表rrs1(81 bp)、rrs2(117 bp)、rrs3(143 bp)、rrs4(206 bp)、rrs5(279 bp)、rrs6(316 bp)、rrs7(433 bp)各擴(kuò)增產(chǎn)物條帶圖2 不同擴(kuò)增片段長(zhǎng)度對(duì)PMAxx-qPCR方法檢測(cè)的影響

綜合比較各組間死活菌ΔCq，發(fā)現(xiàn)10 μmol/L 組ΔCq值明顯高于其他組(6.772±0.453)。故選擇10 μmol/L作為PMAxx鑒別結(jié)核分枝桿菌死活菌的處理濃度。

二、PMAxx-qPCR方法相關(guān)影響因素

1. 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：電泳圖譜顯示所有未進(jìn)行PMAxx預(yù)處理的樣品均出現(xiàn)明亮單一條帶，而隨著靶標(biāo)片段大小變化，PMAxx處理組電泳條帶出現(xiàn)明顯差異。當(dāng)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為81～143 bp時(shí)，PMAxx處理組仍存在較明顯條帶；當(dāng)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為206～433 bp時(shí)，處理組電泳條帶消失，表示經(jīng)PMAxx處理的樣品DNA擴(kuò)增被完全抑制(圖2)。

2. 結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)周期：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PMAxx處理組與未處理組間ΔCq值逐漸升高，從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(2周)的0.575個(gè)循環(huán)升至平臺(tái)抑制期(4周)的2.866個(gè)循環(huán)，且當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為3周和4周時(shí)，PMAxx處理組較未處理組Cq值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示不同生長(zhǎng)周期的結(jié)核分枝桿菌將導(dǎo)致PMAxx檢測(cè)活菌的背景值存在差異(表4)。

三、 PMAxx-qPCR方法檢測(cè)抗結(jié)核藥物的活性

1. 與MABA法比較測(cè)定藥物MIC：根據(jù)PMAxx-qPCR法檢測(cè)獲得的量效曲線(圖3，4)進(jìn)行擇點(diǎn)加權(quán)測(cè)算，得到INH的MIC為0.06 μg/ml(0.049～0.076 μg/ml)，與MABA法(0.032～0.064 μg/ml，t=0.782，P=0.491)一致性良好；而RFP由PMAxx-qPCR方法測(cè)算的MIC為0.121 μg/ml(0.102～0.145 μg/ml)，與MABA法(0.051～0.079 μg/ml，t=2.828，P=0.066)一致性尚可；實(shí)驗(yàn)結(jié)果0.5～2倍MIC值視為可接受范圍。同時(shí)，對(duì)比藥物作用5、7和10 d 的量效曲線，發(fā)現(xiàn)采用PMAxx-qPCR法在作用后第3天即可測(cè)算出藥物的MIC。

表4 PMAxx處理前后qPCR所測(cè)循環(huán)閾值(Cq值)在不同生長(zhǎng)周期結(jié)核分枝桿菌中的比較

虛線表示抑菌率達(dá)到90%最低抑菌濃度；“┰”表示標(biāo)準(zhǔn)差 虛線表示抑菌率達(dá)到90%最低抑菌濃度；“┰”表示標(biāo)準(zhǔn)差圖3 INH量效曲線(PMAxx-qPCR法) 圖4 RFP量效曲線(PMAxx-qPCR法)

2. 與CFU計(jì)數(shù)法比較藥物抗菌活性：定量(終濃度為108CFU/ml)結(jié)核分枝桿菌懸液連續(xù)10倍梯度稀釋，經(jīng)PMAxx處理后分別提取DNA，經(jīng)qPCR檢測(cè)以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線[Cq值/(lg CFU/ml)]，其線性回歸方程為y=-2.566x+45.51，R2=0.9863(圖5)。最低檢測(cè)限為102CFU/ml(Cq=39.616±0.317)。

Cq值：循環(huán)閾值；CFU：菌落形成單位；“┰”表示標(biāo)準(zhǔn)差圖5 結(jié)核分枝桿菌PMAxx-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)方程分別計(jì)算各濃度(16×MIC，8×MIC，4×MIC，2×MIC，1×MIC)INH、RFP作用后10 d抗菌計(jì)數(shù)，CFU計(jì)數(shù)方法結(jié)果和PMAxx-qPCR方法測(cè)定結(jié)果對(duì)比分析見表5，兩種方法測(cè)算一致性良好(P>0.05)(表5)，說(shuō)明PMAxx-qPCR方法可有效快速檢測(cè)抗菌藥物活性。

討 論

特異性膜滲透的核酸染料PMA與高敏感度的熒光定量qPCR檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，可以選擇性檢測(cè)細(xì)胞膜完整的活性病原菌，具有特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、檢疫、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等多領(lǐng)域微生物活性檢測(cè)。本研究使用PMA改良類似物PMAxx[10]區(qū)分結(jié)核分枝桿菌H37Rv活菌和熱滅活菌提供一個(gè)完整的方案，探討方法應(yīng)用的重要影響因素，并應(yīng)用于抗結(jié)核藥物的活性檢測(cè)。

表5 不同MIC倍增濃度的INH、RFP作用10 d后的PMAxx-qPCR法抗菌計(jì)數(shù)和CFU計(jì)數(shù)結(jié)果的比較

注MIC：最低抑菌濃度；CFU：菌落形成單位

根據(jù)多項(xiàng)研究報(bào)道,該方法的建立存在多種影響因素[10]，包括PMA濃度[9]、細(xì)胞死亡方式[11]、樣品的種類或濃度[12]等。在本研究中首先研究了曝光時(shí)間、暗孵育時(shí)間、試劑濃度等幾項(xiàng)關(guān)鍵因素。研究結(jié)果表明，使用濃度為10 μmol/L PMAxx預(yù)處理H37Rv，經(jīng)暗孵育10 min后曝光15 min，可有效區(qū)分活死菌，并避免各項(xiàng)干預(yù)條件導(dǎo)致的假陽(yáng)性反應(yīng)。Lu等[12]利用該方法檢測(cè)痰中培養(yǎng)分離的結(jié)核分枝桿菌，發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)暗孵育時(shí)間可有效提高PMA對(duì)死菌的檢出率，適用濃度范圍為100～800 μmol/L，Dorn-In 等[8]和Pholwat 等[9]研究得出適用濃度為50 μmol/L，均高于本研究中的10 μmol/L，導(dǎo)致以上差異的原因主要考慮以下兩個(gè)方面：(1)本研究采用的是純菌懸液，而Lu等[12]研究中目標(biāo)是臨床痰樣本，Dorn-In等[8]研究目標(biāo)為鹿肉和糞便樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體，復(fù)雜性樣本中非細(xì)胞物質(zhì)可能影響PMA的滲透能力，因此需提高試劑濃度和延長(zhǎng)預(yù)處理時(shí)間以提高其與死菌DNA的結(jié)合率；(2)本方法中應(yīng)用的PMAxx已被證實(shí)滲透能力優(yōu)于PMA[13], 所需量少且處理時(shí)間更短。另外，本研究發(fā)現(xiàn)PMAxx在檢出效率上不受孵育時(shí)間影響。

qPCR是本方法檢測(cè)的主要部分，因此標(biāo)靶基因的識(shí)別和檢測(cè)是影響方法實(shí)施的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)使用較長(zhǎng)的靶標(biāo)片段(206～433 bp)區(qū)分死活結(jié)核分枝桿菌較短片段(81～143 bp)有效，該發(fā)現(xiàn)與多項(xiàng)研究結(jié)果一致；Contreras等[14]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PMA-qPCR方法鑒別非活性鰻弧菌和嗜冷黃桿菌時(shí)，729 bp的靶標(biāo)產(chǎn)物檢出效率明顯優(yōu)于140 bp，且死活菌檢測(cè)差異隨靶標(biāo)片段的擴(kuò)大逐漸升高；Alonso 等[15]研究也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PMA-qPCR方法檢測(cè)熱滅活的十二指腸賈第蟲囊腫時(shí)，采用143 bp/133 bp靶標(biāo)片段的檢出率分別為97.0%和98.2%，而采用77 bp/75 bp時(shí)檢出率明顯降低(89.9%和83.2%)。以下原因可能解釋該現(xiàn)象：據(jù)Opel等[16]報(bào)道，與DNA結(jié)合的PCR抑制劑主要通過(guò)影響DNA聚合酶的作用而影響延伸率，而長(zhǎng)片段較短片段出現(xiàn)DNA聚合酶功能抑制的概率更高，因此使得長(zhǎng)片段對(duì)該類抑制劑更為敏感。

本研究將優(yōu)化后的PMAxx-qPCR方法直接應(yīng)用于一線抗結(jié)核藥物INH、RFP的體外抗菌活性檢測(cè)，首先發(fā)現(xiàn)該方法在藥物作用后3 d即可獲得與國(guó)際通用的MABA法一致性良好的MIC結(jié)果，該發(fā)現(xiàn)與Pholwat等[9]研究結(jié)果一致。因此與需時(shí)較長(zhǎng)的MABA法相比可有效提高檢測(cè)效率。其次，本研究還通過(guò)Cq值/lg CFU/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換獲得藥物作用后活菌計(jì)數(shù)，與傳統(tǒng)CFU計(jì)數(shù)方法結(jié)果一致性良好。Scariot等[17]研究證實(shí)PMA-qPCR方法檢測(cè)酸奶中副干酪乳桿菌和CFU計(jì)數(shù)法的結(jié)果具有極佳的符合率，Roussel等[18]也通過(guò)對(duì)大腸桿菌研究充分證實(shí)PMA-qPCR方法和CFU計(jì)數(shù)法結(jié)果的高度一致性。本研究證實(shí)PMAxx-qPCR方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)的測(cè)算同樣有效，且最低檢測(cè)限可至102CFU/ml，與Zi等[19]研究中的檢測(cè)限結(jié)果一致。總之，PMA-qPCR方法在保證有效、準(zhǔn)確、高敏感度評(píng)價(jià)藥物抗菌活性的前提下，可大大節(jié)省時(shí)間成本，提高檢測(cè)效率，具備成為藥物抗菌活性研究及評(píng)價(jià)工具的潛力。

本研究的局限性在于應(yīng)用PMAxx-qPCR方法僅評(píng)估INH、RFP兩種抗結(jié)核藥物，而抗結(jié)核藥物種類繁多且作用靶點(diǎn)各異，仍需要完善對(duì)其他抗結(jié)核藥物的活性檢測(cè)以評(píng)估方法的應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果表明，PMAxx在適宜的處理?xiàng)l件下，可有效抑制對(duì)死菌DNA的擴(kuò)增，聯(lián)合qPCR時(shí)可作為一種快速、準(zhǔn)確的分子藥敏檢測(cè)方法，敏感度高，可有效檢測(cè)藥物抗菌活性，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，一致性良好且需時(shí)更短。