福建省非結核分枝桿菌菌種分布及其流行病學特征初步研究

林建 林淑芳 戴志松 趙永 魏淑貞 周銀發(fā)

非結核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)是一種重要的條件致病菌, 是指除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌，目前已鑒定出170余種[1]。其廣泛存在于自然環(huán)境中，也可生長在人為環(huán)境中；可定植、感染人體或導致NTM病的發(fā)生，主要危害慢性肺部疾病患者、免疫力低下患者及醫(yī)院感染人群[2-4]。根據全國及福建省結核病流行病學調查結果顯示，福建省NTM的檢出率高于2010年全國流行病學調查結果，并呈上升趨勢[4-5]。NTM具有種類多及天然多耐藥等特點，導致NTM病診治較為困難，而目前尚未建立公認的兼?zhèn)淞畠r、快速、敏感度和特異度較高等特點的標準化診斷技術[6]，因此了解 NTM菌種分布及流行病學特征對于NTM病早期防治具有重要指導意義。筆者通過對福建省各耐藥監(jiān)測點收集的疑似NTM病患者的標本進行菌種鑒定和流行病學分析，為福建省制定NTM病防治策略提供科學依據。

資料和方法

一、一般資料

菌株來源于福建省9個省級耐藥監(jiān)測點(每個地市1個縣作為監(jiān)測點)以及2個國家級耐藥監(jiān)測點(漳州市龍海市與龍巖市長汀縣)。共收集2016—2018年11個監(jiān)測點發(fā)現的190例疑似NTM病的菌株標本。本研究患者基本信息和資料來自于《全國結核病耐藥性監(jiān)測實施方案》中提供的《結核病耐藥性監(jiān)測患者信息表》，以及中國疾病預防控制中心的《結核病管理信息系統(tǒng)》。

二、實驗方法

1. 初步菌種鑒定：采用對硝基苯甲酸(P-nitrobenzoic acid, PNB)試驗進行初步菌種鑒定。嚴格按照《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》[7]要求，將監(jiān)測點收集的痰標本分離培養(yǎng)的陽性產物，在中性固體培養(yǎng)基上傳代，取3周的亞培養(yǎng)物經磨菌及稀釋到最終濃度為10-1mg/ml，接種到含PNB的固體培養(yǎng)基上，并設立陽性(堪薩斯分枝桿菌)與陰性對照(結核分枝桿菌H37RV)。培養(yǎng)基采用珠海貝索生物科技有限公司生產的中性及含PNB的改良羅氏培養(yǎng)基。

2. 熒光PCR熔解曲線法：將初步鑒定為NTM的190例感染者的菌株標本，采用熒光PCR熔解曲線法進行菌種鑒定。試劑盒采用廈門致善生物科技股份有限公司生產的分枝桿菌鑒定試劑盒，該試劑盒可覆蓋19種分枝桿菌。嚴格按照試劑盒說明書操作，對樣品進行提取和擴增，并設立陰性與陽性對照，根據檢測樣品各通道中熔解曲線的熔點組合來判斷分枝桿菌類型。

三、統(tǒng)計學處理

通過Excel 2016軟件對實驗數據及患者信息進行整理，采用SPSS 24.0軟件對感染NTM患者的信息進行描述性分析。采用非參數檢驗分析不同特征患者感染的NTM菌種分布特征，采用卡方檢驗比較感染胞內分枝桿菌與非胞內NTM患者特征，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、菌種鑒定結果

190例疑似NTM病菌株標本中，12例未檢出分枝桿菌(6.3%)，17例僅檢出結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)(9.0%)，其余161例均檢出NTM(84.7%)，其中8例不在試劑盒所涵蓋的19種分枝桿菌范圍內，鑒定結果為其他分枝桿菌。除其他分枝桿菌外，共檢出8種NTM。98例檢出胞內分枝桿菌，占60.9%(98/161)，膿腫分枝桿菌占19.9%(32/161)。其中2例為NTM間混合感染，6例為MTB與NTM混合感染(表1)。

二、NTM感染者基本情況

161例感染NTM患者中，最小年齡22歲，最大年齡84歲，平均年齡(57.3±13.0)歲，主要集中在45～60歲間，占60.9%(98/161)；男113例，占70.2%；本地戶籍140例，占87.0%；農民工117例，占72.7%；漢族157例，占97.5%；125例患者現住址在沿海城市，占77.6%。非參數檢驗結果表明不同性別、年齡及民族患者感染的NTM菌種分布差異有統(tǒng)計學意義；除<30歲外，其他年齡段均是胞內分枝桿菌占比最高；男性患者不僅例數較多且菌種類別也較多，4例偶然分枝桿菌中有3例為女性患者感染；少數民族患者僅4例且均為非胞內NTM感染(表2)。

表1 190例疑似NTM病患者標本的菌種鑒定結果

表2 患者各類社會人口學特征在161例不同NTM感染者中的分布

注a：序號代表的菌種參照表1

表3 各類社會人口學特征在胞內分枝桿菌與非胞內分枝桿菌感染患者中的分布

三、感染胞內分枝桿菌患者的臨床特征及其與非胞內分枝桿菌間的比較

98例胞內分枝桿菌感染患者，年齡最小24歲，最大84歲，平均年齡(58.23±11.70)歲，主要集中在45～60歲之間，占63.3%；男性占71.4%，農民工占76.5%，本地戶籍占88.8%，現住址為沿海者占74.5%。感染胞內分枝桿菌與非胞內分枝桿菌患者間性別、年齡、職業(yè)、戶籍以及現住址是否沿海差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.185、4.202、1.879、0.731、1.431，P值均>0.05)；另外，研究中發(fā)現感染胞內分枝桿菌患者均為漢族，而感染非胞內分枝桿菌患者有4例為少數民族(χ2=4.029,P<0.05)(表3)。

討 論

福建省161例NTM病患者主要為本地戶籍，并且以漢族、男性、中老年人、農民工居多，且不同性別、年齡、民族間NTM菌種分布差異均有統(tǒng)計學意義；本地戶籍及漢族人群基數較大，而男性、農民工和中老年人有喝酒、抽煙等不良習慣較多，存在呼吸道基礎疾病，或由于其經常在戶外的工作性質易接觸到水和土壤中的NTM有關[8-10]。因此，具有本地戶籍、漢族、男性、中老年或農民工這些社會人口學特征的人群是NTM病防治的重點人群，在防治過程中需有針對性地采取相應的措施。值得關注的是，研究中發(fā)現偶然分枝桿菌感染者4例，其中3例是女性患者；少數民族患者僅4例且均是感染非胞內分枝桿菌，由于樣本量較少，部分NTM是否存在易感人群，需進一步增大樣本量進行深入研究。

既往研究表明，NTM菌種分布存在地域特點，不同國家或同一個國家不同地區(qū)都會存在明顯不同的分布特點[11-12]。我國NTM主要以胞內分枝桿菌和膿腫分枝桿菌為主，但以何種居多，又存在不同的地域特點。北京和上海等地區(qū)主要以胞內分枝桿菌分布居多，而廣東及重慶等省份以膿腫分枝桿菌居多[10,13-15]。本研究結果顯示，福建省的NTM主要以胞內分枝桿菌為主，其次是膿腫分枝桿菌，但現住址為內陸和沿海的NTM菌種分布差異無統(tǒng)計學意義。目前，尚未明確NTM這種地域分布是何種原因或何種機制導致的，仍需進一步收集數據開展相應的研究。通過比較感染胞內分枝桿菌和非胞內分枝桿菌患者的特征，結果表明雖然感染胞內分枝桿菌的患者占絕大多數，但其年齡、性別、職業(yè)、戶籍，以及現住址是否沿海等社會人口學特征卻與感染非胞內分枝桿菌患者間差異均無統(tǒng)計學意義，表明不同特征的患者對于胞內分枝桿菌與非胞內分枝桿菌的易感性無明顯的差別。另外，研究中發(fā)現感染胞內分枝桿菌的患者均為漢族，而感染非胞內分枝桿菌患者中有4例為少數民族，差異有統(tǒng)計學意義；但由于少數民族患者例數較少，因此這是否與患者的居住環(huán)境及易感性有關，仍需進一步收集資料進行研究。

本研究存在一定的局限性：(1)研究發(fā)現經過含PNB的培養(yǎng)基初篩的190例疑似NTM病患者中，通過熒光PCR熔解曲線法有9.0%僅檢出結核分枝桿菌，表明PNB試驗對于區(qū)分結核分枝桿菌與NTM存在一定的局限性。既往研究表明，存在部分結核分枝桿菌對PNB耐藥，從而可在含PNB培養(yǎng)基上生長, 同時PNB還會對部分NTM有抑制作用，導致其無法在培養(yǎng)基上生長[16]；因此，本研究初篩使用PNB試驗，存在部分NTM無法在PNB培養(yǎng)基上生長的可能，從而未納入本研究中。(2)熒光PCR熔解曲線法僅能識別19種NTM，研究中存在部分菌種超出試劑盒識別范圍，但是未采用其他方法進行進一步的鑒定，直接將上述菌種納入其他分枝桿菌中，對結果分析會造成一定的影響。(3)本研究收集的NTM病患者例數也較少，且未收集統(tǒng)計分離的結核分枝桿菌及其患者情況，無法通過對比分析NTM病與結核感染患者間的特征提供更多的科學依據。

綜上所述，福建省NTM病患者主要以漢族、本地戶籍、男性、中老年人、農民工居多；菌種分布以胞內分枝桿菌為主，其次為膿腫分枝桿菌；不同性別、年齡、民族間NTM菌種分布差異均有統(tǒng)計學意義。在NTM病防治過程中需根據既往感染患者的社會人口學及菌種分布特征，并結合當地實際情況制定更有針對性的防治策略與措施。

志謝福建省疾病預防控制中心陳代權對本研究中的統(tǒng)計學方法和結果進行了審核。