TRAIL與上皮性卵巢癌中耐藥相關(guān)基因的關(guān)系

張鳳喜 常玉梅 崔允巍 王春香 郭翠蓮 易潔

在臨床統(tǒng)計(jì)中，卵巢上皮癌的病死率居于各類卵巢癌的第一位[1]，而且在卵巢惡性腫瘤中，上皮性卵巢癌是最常見的一種卵巢癌。因其發(fā)病隱匿，早期無明顯癥狀且缺乏診斷依據(jù)，故卵巢癌的早期診斷是一難題，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命[2]。上皮性卵巢癌目前的主要治療方案是手術(shù)治療聯(lián)合化療進(jìn)行。有報(bào)道稱約25%的卵巢癌患者存在原發(fā)性耐藥，而將近75%的卵巢癌患者存在繼發(fā)性耐藥[3]。卵巢癌病死率比較高，其中一個(gè)重要的原因應(yīng)該與卵巢癌的多藥耐藥性密切相關(guān)，卵巢癌的多藥耐藥性是卵巢癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要原因?；熓锹殉舶┗颊咝g(shù)后首選的輔助治療方法。然而化療的卵巢癌患者中有一部分存在繼發(fā)性耐藥。腫瘤壞死因子相關(guān)調(diào)亡誘導(dǎo)配體(tumornecrosisfactor related apopto sis inducing ligand,TRAIL)是近幾年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的 TNF家族成員,TRAIL因子最大特點(diǎn)是選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，對(duì)正常細(xì)胞無誘導(dǎo)凋亡作用[4]，因此 TRAIL已經(jīng)成為抗癌研究的熱點(diǎn)，本試驗(yàn)通過檢測(cè)TRAIL和耐藥相關(guān)蛋白 MDR1、LIVIN、 TOPOⅠ、 TOPOⅡ、 PTEN、 ERCC1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)，探討 TRAIL與上皮性卵巢癌臨床分期及耐藥相關(guān)基因的關(guān)系，篩選出和 TRAIL相關(guān)的耐藥因子，從而為預(yù)測(cè)卵巢癌的耐藥并指導(dǎo)臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 選擇衡水市婦幼保健院2014年卵巢癌患者50例，年齡39～68歲,平均年齡(50.4±2.5)歲；病程8個(gè)月～5年,平均病程為(2.8±0.4)年,標(biāo)本均經(jīng)病理科專業(yè)人員切片閱讀，術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)為上皮性卵巢癌，并且所有的病例術(shù)后病理結(jié)果均含有耐藥相關(guān)基因MDR1、PTEN、TOPOⅠ、TOPOⅡ、ERCC1、LIVIN的免疫組化結(jié)果。其中MDR1(-)14例，MDR1(+)16例，MDR1(++)10例，MDR1(+++)10例；LIVIN (-)24例，LIVIN (+)，18例，LIVIN (++)4例,LIVIN (+++)4例；PTEN(-)18例，PTEN(+)9例,PTEN(++)10例，PTEN(+++)13例；TOPOⅠ(-)16例，TOPOⅠ(+)9例，TOPOⅠ(++)22例，TOPOⅠ(+++)3例；TOPOⅡ(-)14例，TOPOⅡ(+)11例,TOPOⅡ(++)20例，TOPOⅡ(+++)5例；ERCC1(-)12例，ERCC1(+)10例，ERCC1(++)25例，ERCC1(+++)3例。所選取的病例未進(jìn)行術(shù)前的任何治療，如放療、化療及免疫治療等。均為首次手術(shù)治療。

1.2 試劑與方法 鼠抗人TRAIL單克隆抗體(濃縮型)。SP試劑盒；DAB試劑盒；磷酸鹽緩沖液(PBS)；將一包磷酸鹽緩沖液粉劑用1 000 ml蒸餾水稀釋,搖勻后備用。將pH值控制在7.2～7.4。用2 000 ml的蒸餾水將一包枸椽酸緩沖液粉劑進(jìn)行稀釋,搖勻后備用，將pH值控制在6.0～7.0。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定 采用SP免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)，染色判定所有切片用Olympus光學(xué)顯微鏡(CH-20 )進(jìn)行觀察，TRAIL細(xì)胞漿或細(xì)胞膜被染成棕黃色判定為陽性，連續(xù)觀察5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(0～4分)和染色強(qiáng)度(0～3分),二者為免的積為免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)(IRS),IRS 0 分時(shí)為陰性(-)，1～4分時(shí)為弱陽性(+)，5～8分時(shí)為陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。計(jì)算百分比時(shí)，陰性為0分，<5%為1分，6%～10%為2分,11%～30%為3分,>30%為4分；著色強(qiáng)度觀察，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，無著色為0分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件,TRAIL在不同卵巢組織及卵巢癌分期中的表達(dá)率的差異采用χ2檢驗(yàn)，TRAIL與幾種耐藥相關(guān)因子MDR1、LIVIN、TOPOⅠ、TOPOⅡ、PTEN、ERCC1的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAIL因子和MDR1在卵巢癌中的表達(dá) TRAIL隨MDR1表達(dá)漸強(qiáng)而逐漸減弱，兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 TRAIL因子和LIVIN在卵巢癌中的表達(dá) TRAIL隨LIVIN表達(dá)漸強(qiáng)，至LIVIN(++)達(dá)到峰值(P<0.05)。TRAIL因子表達(dá)沒有規(guī)律性。見表2。

表1 TRAIL因子和MDR1在卵巢癌中的表達(dá) 例

注：與MDR1(-)比較，*P<0.05；與MDR1(+)比較，#P<0.05；與MDR1(++)比較，△P<0.05

表2 TRAIL因子和LIVIN在卵巢癌中的表達(dá) 例

注：與LIVIN(-)比較，*P<0.05；與LIVIN(+)比較，#P<0.05；與LIVIN(++)比較，△P<0.05

2.3 TRAIL因子和TOPOⅠ在卵巢癌中的表達(dá) TRAIL陽性率在TOPOⅠ(-)、(+)、(+++)表達(dá)明顯高于TOPOⅠ(++)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 TRAIL因子和TOPOⅠ在卵巢癌中的表達(dá) 例

注：與TOPOⅠ(-)比較，*P<0.05；與TOPOⅠ(+)比較，#P<0.05；與TOPOⅠ(++)比較，△P<0.05

2.4 TRAIL因子和TOPOⅡ在卵巢癌中的表達(dá) TRAIL陽性率在TOPOⅡ(-)、(+)、(++)表達(dá)高于TOPOⅡ(+++)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.5)。見表4。

表4 TRAIL因子和TOPOⅡ在卵巢癌中的表達(dá) 例

注：與TOPOⅡ(-)比較，*P<0.05；與TOPOⅡ(+)比較，#P<0.05；與TOPOⅡ(++)比較，△P<0.05

2.5 TRAIL因子和PTEN在卵巢癌中的表達(dá) TRAIL陽性率在PTEN(-)、(+)表達(dá)高于PTEN(++)、(+++)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.5)。見表5。

2.6 TRAIL因子和ERCC1在卵巢癌中的表達(dá) TRAIL陽性率在ERCC1(-)、(+)表達(dá)高于ERCC1(++)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.5)。見表6。

2.7 相關(guān)性分析 TRAIL與MDR1在卵巢癌中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-1,P=0)，與LIVIN、TOPOⅠ、TOPOⅡ、PTEN、ERCC1表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。見表7。

表5 TRAIL因子和PTEN在卵巢癌中的表達(dá) 例

注：與PTEN(-)比較，*P<0.05；與PTEN(+)比較，#P<0.05；與PTEN(++)比較，△P<0.05

表6 TRAIL因子和ERCC1在卵巢癌中的表達(dá) 例

注：與ERCC1(-)比較，*P<0.05；與ERCC1(+)比較，#P<0.05

表7 TRAIL因子和TRAIL MDR1 LIVIN TOPOⅠ TOPOⅡ PTEN ERCC1的相關(guān)性分析

3 討論

卵巢癌是一種嚴(yán)重危害女性健康,惡性度很高的腫瘤,在女性生殖器官的惡性腫瘤發(fā)病率中僅低于子宮內(nèi)膜癌,在卵巢癌的發(fā)病類型中最常見的一種是卵巢上皮癌,在臨床統(tǒng)計(jì)中,卵巢上皮癌的病死率居于各類卵巢癌類型中的第一位,占卵巢癌的90%～95%,據(jù)報(bào)道,世界每年新增卵巢癌病例20.4萬,死亡人數(shù)12.5萬[5],卵巢癌的惡性程度和病因?qū)W目前尚不完全清楚。因?yàn)槁殉舶┰缙诎l(fā)病癥狀不典型且缺乏診斷依據(jù)，無較敏感和特異的生物標(biāo)志物,所以卵巢癌發(fā)病早期無明顯癥狀,易被忽視,故約70%的卵巢癌患者確診時(shí)已至晚期,且卵巢癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),有部分患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，且晚期患者治療困難，預(yù)后較差，5年生存率大約40%[6]，雖然醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，化療方案不斷改進(jìn)，但卵巢上皮性卵巢癌患者的5年生存率并沒有顯著的提高，患者的腫瘤分期、分化程度、轉(zhuǎn)移等均影響患者預(yù)后，是評(píng)估患者生存率的重要因素，部分可手術(shù)的患者的主要治療方案是手術(shù)治療聯(lián)合化療進(jìn)行，即使初次治療有效，但仍有4/5左右的患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，卵巢癌病死率高的原因之一是與卵巢癌的多藥耐藥性密切相關(guān),導(dǎo)致了患者預(yù)后不良，因此尋找新的腫瘤標(biāo)志物和治療手段對(duì)卵巢癌患者的診療和預(yù)后尤為重要,到目前為止仍然沒有十分有效的治療方法，近年來，尋找具有生物活性的細(xì)胞毒性分子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡逐漸成為卵巢癌生物治療領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。

TRAIL是最近這幾年被發(fā)現(xiàn)的可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡的TNF家族成員之一,又稱為凋亡素2配體。其最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞走向凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞來講，TRAIL不會(huì)產(chǎn)生任何毒副作用[7]，所以目前TRAIL已成為許多學(xué)者的研究熱點(diǎn)，并有希望成為新一代的研究藥物。研究表明,人的體內(nèi)所包含的TRAIL基因中存在有一個(gè)開放的讀碼框,它定位于3號(hào)染色體的3q26上的,是非常典型的跨膜糖蛋白,它編碼一個(gè)由281個(gè)氨基酸所構(gòu)成的前體蛋白[8]。在金屬蛋白酶的作用下,TRAIL的胞外區(qū)碳(C)末端的114～281氨基酸可形成一個(gè)同源三聚體結(jié)構(gòu),是可溶型蛋白(soluble TRAIL,sTRAIL)。研究發(fā)現(xiàn),TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的方式,是通過與靶細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合而完成[9]。TRAIL一共包含5個(gè)受體，包括TRAILR1(DR4)、TRAILR2(DR5)、TRAILR3(DClR1)、TRAILR4(DClR2)以及OPG。DR4、DR5是死亡受體，在不同腫瘤細(xì)胞組織及正常細(xì)胞組織中均有不同程度的差異化表達(dá)；DCR1、DCR2、OPG是誘騙受體，通常只在正常組織中表達(dá)，而在腫瘤組織中不表達(dá)[10]。在正常組織中，DCR1、DCR2通過與死亡受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TRAIL，而使正常組織逃逸TRAIL的殺傷作用。因此，TRAIL在有選擇性的來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面非常有效。TRAIL通過與死亡受體特異性的作用，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，放大和傳送凋亡信號(hào)，從而誘導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。通過對(duì)卵巢癌細(xì)胞的研究得出結(jié)論，可能存在兩種以上的TRAIL信號(hào)傳導(dǎo)途徑，細(xì)胞FLICE抑制蛋白的表達(dá)。有研究通過轉(zhuǎn)染TRAIL的內(nèi)皮祖細(xì)胞作用于卵巢癌動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)對(duì)移植瘤具有抑制的作用，為卵巢癌靶向治療應(yīng)用于臨床提供了非常有力的支持[12]。有研究發(fā)現(xiàn)無論是與化療藥物聯(lián)合治療，還是利用TRAIL單獨(dú)治療,均取得了腫瘤細(xì)胞株一致的結(jié)果引起腫瘤退化,生長變慢,甚至消失,且沒有產(chǎn)生很嚴(yán)重的毒副作用[13]。研究表明，TRAIL可抑制許多癌癥細(xì)胞(包括白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，黑色素瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，膽管癌，甲狀腺癌)的生長，提示TRAIL成為一種強(qiáng)有力的抗腫瘤制劑的可行性[14]。

在原發(fā)性卵巢癌中，有88%至少表達(dá)一種死亡受體，在化療前后分別檢測(cè)受體水平，發(fā)現(xiàn)死亡受體的表達(dá)率明顯增高。因此可見，化療藥物可能通過上凋死亡受體的水平達(dá)到TRAIL誘導(dǎo)凋亡的作用,雖然卵巢癌對(duì)化療相對(duì)敏感,但從臨床治療來看，治療效果很是不理想,藥物耐受是應(yīng)該是治療失敗的一個(gè)重要因素,多藥耐藥基因1是第一個(gè)被確定的多藥耐藥相關(guān)基因，即當(dāng)腫瘤細(xì)胞長時(shí)間接受某一種化療藥物的持續(xù)治療時(shí),就會(huì)逐漸產(chǎn)生出對(duì)這種化療藥物的耐藥性,從而使治療愈發(fā)困難，而且這同時(shí)還能夠?qū)ζ渌恍┙Y(jié)構(gòu)和功能不同的多種化療藥物衍生出交叉耐藥性。耐藥性是腫瘤細(xì)胞在接受治療時(shí)，為避免化療藥物攻擊而產(chǎn)生的非常重要的抵制措施,這也是引起化療失敗的最主要因素之一。研究表明，單獨(dú)使用順鉑、紫杉醇、阿霉素、TRAIL治療和使用TRAIL 與這些化療藥物配合治療存在很大差異，在單獨(dú)使用TRAIL治療時(shí)，耐藥細(xì)胞系仍然在抵抗，但在使用TRAIL 與這些化療藥物配合治療時(shí)則耐藥細(xì)胞系的凋亡水平有了明顯提高[15]。在體外試驗(yàn)研究中，使用TRAIL 與這些化療藥物配合治療時(shí)，可減小化療藥物的劑量，而且逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的抵抗轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞敏感。試驗(yàn)還表明，TNF 還可以利用直接降低MDR1 基因的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度不斷升高，并進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)由P-gp的經(jīng)典MDR[16]。然而，作為TNF 超家族成員之一，TRAIL是不是與TNF 相仿，是通過降低耐藥相關(guān)因子的表達(dá)增加化療藥物在腫瘤細(xì)胞中的蓄積而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的耐藥性，目前還沒有相關(guān)報(bào)道。

由于卵巢癌對(duì)化療藥耐藥涉及多個(gè)基因,因此需要實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的表達(dá)才能更好地判斷預(yù)后,本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化的方法對(duì)TRAIL 因子與幾種耐藥基因MDR1、 LIVIN、TOPOⅠ、TOPOⅡ、PTEN、ERCC1的相關(guān)性進(jìn)行了分析,分析耐藥基因表達(dá)與TRAIL 因子的關(guān)系,如果以單個(gè)基因比較,僅MDR1和TRAIL的表達(dá)有關(guān),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TRAIL 因子與耐藥基因MDR1之間存在著負(fù)相關(guān)(r=-1,P=0)的聯(lián)系。TRAIL 或許是利用減小耐藥基因MDR1 并減小其編碼的P-gp 表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長并進(jìn)一步促使其凋亡，從而參與逆轉(zhuǎn)卵巢癌的多藥耐藥。更深入的研究TRAIL 逆轉(zhuǎn)卵巢癌MDR 的機(jī)制，進(jìn)一步分析化療藥物與TRAIL 結(jié)合應(yīng)用TRAIL對(duì)卵巢癌細(xì)胞株耐藥基因表達(dá)的影響，還有利用TRAIL 受體作為中間環(huán)節(jié)將TRAIL 與耐藥基因聯(lián)系起來的可能性，都將有待于下一階段的研究。

另外本實(shí)驗(yàn)對(duì)TRAIL和耐藥因子LIVIN、TOPOⅠ、TOPOⅡ、PTEN、ERCC1的相關(guān)性也進(jìn)行了分析，通過秩相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析，TRAIL和LIVIN(r=0.105,P=0.895),TRAIL和TOPOⅠ(r=-0.8,P=0.2)，TRAIL和TOPOⅡ(r=-0.798,P=0.26)，TRAIL和PTEN(r=0.861,P=0.23)TRAIL和ERCC1(r=-0.801,P=0.21) TRAIL和耐藥因子LIVIN、、TOPOⅠ、TOPOⅡ、PTEN、ERCC1無相關(guān)性。

綜上所述，卵巢癌是臨床上常見的惡性腫瘤,惡性度高，預(yù)后差。隨著TRAIL 基因所誘導(dǎo)的新的腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，可能為卵巢癌提供一種新的治療途徑。雖然，應(yīng)用TRAIL作為化療藥物來對(duì)卵巢癌進(jìn)行治療的技術(shù)還不是很成熟,但是隨著體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)

物實(shí)驗(yàn)研究的不斷深入,已越來越可能成為現(xiàn)實(shí)。TRAIL 作為化療藥物應(yīng)用于卵巢癌的治療可以提高化療療效并與化療藥物具有協(xié)同作用,從而可以減少其他化療藥物的劑量,以消弱化療藥物在臨床治療中所產(chǎn)生的毒性作用及不良反應(yīng)。