C1orf 61對肝細胞肝癌細胞遷移能力的影響及作用機制研究

鄒強生 魏貞 蔣婷 李姍

肝細胞肝癌是一種病死率較高的原發性肝癌，癌細胞排列形成實性團塊狀，周圍富有擴張的血竇，且癌細胞界限不清，大小一致[1]。肝細胞肝癌流行病學調查顯示，發病地區以非洲、東亞地區為主，大洋洲、南北美洲、歐洲等發病率較低[2]。C1orf 61是一種促進肝癌發生和發展的較為重要的因子，隨著肝癌病程的延長，C1orf 61表達水平逐漸升高。且有研究表明，C1orf 61可促進細胞的增殖和克隆；C1orf 61和骨肉瘤、骨髓瘤及肝細胞肝癌的發生發展有關，C1orf 61在正常骨組織中的表達量高于異常骨組織，在骨骼瘤疾病中表達量較低，但在正常肝組織中與之相反，在正常肝組織中的表達相對較低，在肝硬化或者肝癌組織中的表達水平中顯著升高[3]。研究C1orf 61是否參與肝細胞肝癌的發生發展，在本文實驗中觀察C1orf 61對肝細胞肝癌細胞遷移能力的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究細胞：肝細胞肝癌細胞HepG2細胞，購于武漢普諾賽生命科技有限公司，本次研究中的相關事宜均獲得我院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑：小鼠抗人C1orf 61抗體(購于美國Gene Copoeia)，兔抗人E-cadherin抗體(購于義翹神州生物技術有限公司)，MTT試劑盒、Transwell試劑盒(均購自于武漢博士德生物工程有限公司)；PBS緩沖液(購自于北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：將凍存的肝細胞肝癌細胞HepG2細胞取出后，快速采用40℃溫度火浴，迅速搖晃均勻到融化，加入2 ml的培養基[10%PBS，10%～15%56 ml胎牛血清，1%的5.56 ml雙抗(青鏈霉素)，500 ml RPMI-1640培養基]，1 000 r/min，離心5 min處理，棄上清液，使用完全培養液重懸，之后進行傳代至培養瓶中，培養基加至5 ml，在CO2培養箱中培養(濕度飽和95%。溫度37℃、CO2濃度5%)，第2天換液，當培養瓶中細胞融合率達80%～90%進行傳代。

1.2.2 轉染及分組：取對數生長期HepG2細胞，每孔中大約20×104個HepG2細胞，接種于6孔板中，對其進行培養，培養24 h后，按照轉染試劑說明書進行，轉染后在培養箱中培養6 h后，更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養。轉染后繼續培養48 h后，提取細胞蛋白。分為轉染C1orf 61陽性處理組(HepG2-C1orf 61組)和轉染C1orf 61陰性對照組(HepG2-NC組)。

1.2.3 Western blot檢測C1orf 61、p-STAT3、p-Akt蛋白的相對表達：將采集到的細胞，使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細胞裂解液，裂解處理35 min，之后提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質，通過10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V,電泳10 min，之后再將電轉膜浸泡在10%的牛奶中，37℃環境下搖床上封閉1.5 h；與一抗結合，加入TBST稀釋按1∶1 000稀釋一抗β-actin(內參照)，在4℃的環境下孵育過夜保存；24 h后用TBST緩沖液清洗，與二抗結合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液清洗反復清洗。最后加入顯影劑將其浸在底物溶液中進行顯色，嚴格按照顯影定影試劑盒操作說明書進行。

1.2.4 細胞劃痕實驗檢測HepG2細胞遷移能力：將HepG2細胞接種到18孔板中，當細胞增長到90%時，使用100 μl的槍頭,垂直劃出3條直線。之后經過PBS緩沖液進行清洗2～3次，分別加入0.5%的血清培養基，觀察24 h后，使用倒置顯微鏡觀察各組細胞的遷移變化。

1.2.5 Transwell小室檢測細胞侵襲能力：將處于對數生長期的HepG2細胞取出，調整細胞密度為3×105/ml，并使用濃度為1%的血清培養基重懸細胞，將100 μl 的細胞懸液加入每一個小室中。在培養板上放入Transwell小室，加入無血清培養基，靜置0.5 h后使基質膠再水化。向Transwell小室中加入細胞懸液，混合血清培養基在飽和濕度環境下培養24 h，之后進行染色處理，將其取出用PBS緩沖液漂洗，使用多聚甲醛將其固定后采用結晶紫染色法進行染色，每一組均染色15 min，最后用PBS漂洗3次。使用顯微鏡對隨機選取的5個小孔視野拍照，每一組均重復進行3次的細胞數目統計步驟。

1.2.6 RT-PCR、Western blot檢測轉染后E-cadherin mRNA和蛋白的表達：采用熒光定量RT-PCR技術進行檢測，嚴格按照定量PCR儀的操作說明書進行。依次加入2.5 μl稀釋10倍的PCR緩沖液，1.5 μl MgCl2溶液，0.5 μl上游引物和下游引物，最后加水配成總體積為25 μl的反應體系。在94℃環境中反應1 min；55℃環境中反應1 min；72℃環境中反應1 min，進行35個循環，72℃環境中反應延長5 min，重復最少3次。采用2-ΔΔCt方法計算出需要檢測的E-cadherin mRNA表達水平。Western blot檢測方法同1.2.3。

2 結果

2.1 轉染后2組細胞C1orf 61蛋白相對表達量比較 HepG2-C1orf 61組C1orf 61蛋白相對表達量高于HepG2-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

組別C1orf 61HepG2-C1orf 61組1.57±0.23HepG2-NC組 0.73±0.04t值11.38P值<0.05

2.2 轉染后2組細胞遷移能力比較 HepG2-C1orf 61組HepG2細胞遷移距離均小于HepG2-NC組，遷移數量均多于HepG2-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖1。

2.3 轉染后2組細胞p-STAT3和p-Akt蛋白相對表達量比較 HepG2-C1orf 61組p-STAT3、p-Akt蛋白相對表達量高于HepG2-NC組(P<0.05)。見表3。

組別0 h24 h48 hHepG2-C1orf 61組100.00±0.0048.57±2.2424.17±1.23HepG2-NC組 100.00±0.0063.24±3.4542.57±3.47t值3.1611.2815.80P值>0.05<0.05<0.05

圖1 轉染后2組細胞遷移能力比較(×100)

組別p-STAT3p-AktHepG2-C1orf 61組0.96±0.121.02±0.19HepG2-NC組 0.52±0.040.46±0.02t值11.009.27P值<0.05<0.05

2.4 轉染后2組細胞E-cadherin mRNA、E-cadherin蛋白相對表達量比較 轉染后，HepG2-C1orf 61組E-cadherin mRNA、E-cadherin蛋白相對表達量均低于HepG2-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

組別E-cadherin mRNAE-cadherinHepG2-C1orf 61組0.54±0.030.62±0.04HepG2-NC組 1.23±0.140.98±0.12t值15.249.00P值<0.05<0.05

2.5 轉染后2組細胞侵襲能力比較 HepG2-C1orf 61組細胞侵襲能力顯著高于HepG2-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖2。

組別0 h24 h48 hHepG2-C1orf 61組6.12±0.5020.45±2.4750.57±5.24HepG2-NC組 5.23±0.5713.56±1.0238.59±3.23t值3.718.156.15P值>0.05<0.05<0.05

圖2 轉染后2組細胞侵襲能力比較(結晶紫染色×400)

3 討論

肝細胞肝癌患者在就診時常常為中晚期，患者預后較差，且治療效果往往不理想，且大多數患者治療失敗與腫瘤發生轉移相關[4,5]。肝細胞肝癌是較為常見的惡性程度較高的腫瘤，我國是世界上肝細胞肝癌發病率較高的國家，且新發例數大于占世界總肝癌新發例數的一半左右[6,7]。在本文研究實驗中，對C1orf 61與肝細胞肝癌細胞遷移的關系及可能的作用機制進行研究，以為臨床上肝細胞肝癌的治療提供新方向。

C1orf61又名CROC-4，位于1號染色體長臂22區，在肝細胞肝癌的發生發展過程中基因頻繁發生突變的區段。C1orf61中含有豐富的絲氨酸和蘇氨酸，同時包含Wallker A、SH3結構域，其中Wallker A結構域能對C1orf61和DNA進行介導使其結合，對基因轉錄進行調控；SH3結構域可對C1orf61和分子間進行介導，使其相互作用，對激酶催化活性進行調節，從而對信號轉導途徑產生影響。C1orf61在人腦中的表達較高，而在其他組織中的表達較低，主要在丘腦、尾狀核、海馬體等部位中呈現高表達，參與腦發育的過程；C1orf 61在肝臟的形成中有著重要的作用，人體胚胎在發育4～9周時是肝臟形成較為重要的時期，且隨著胚胎發育進程的增加，C1orf 61在第4周時開始出現升高的趨勢，之后到達峰值，最終在第9周C1orf 61開始呈現低表達。通過組織芯片技術對C1orf 61在肝癌組織中的表達進行檢測，結果顯示，C1orf 61在肝癌組織中的表達高于正常肝組織，并且C1orf 61表達量隨著肝癌病程的增加逐漸增加，C1orf 61和肝癌的發展密切相關。另有研究發現C1orf 61在肝癌細胞中的表達量較高，能促進肝癌細胞的增殖和克隆，促進肝癌細胞的遷移。C1orf 61可通過上皮間質轉化相關基因蛋白誘導上皮間質轉化的發生。在本文研究實驗中，將C1orf 61轉染至肝細胞肝癌HepG2細胞中，建立HepG2-C1orf 61組和空載體HepG2-NC組，對2組細胞轉染后C1orf 61進行檢測，結果顯示，HepG2-C1orf 61組細胞中C1orf 61蛋白相對表達量顯著高于空載體組，此結果說明C1orf 61在肝細胞肝癌HepG2細胞中呈現異常的高表達量，參與肝細胞肝癌的發生過程。

肝細胞肝癌的轉移與較多的基因和蛋白分子、轉移相關信號通路出現異常有關，上皮間質轉化是一種癌細胞獲得遷移能力的較為重要的分子機制，屬于一種較為復雜的動態變化過程[8]。細胞骨架的重構是發生上皮間質轉化的途徑，表現為上皮細胞通過上皮間質轉化獲得間質細胞的表型[9-11]。上皮間質轉化在胚胎發育、組織重建及癌癥轉移過程中有著重要的作用，主要的特征表現為E-cadherin、角蛋白及β-catenin表達下調和間質細胞表型的N-cadherin、波形蛋白的上調，通過上述因子蛋白的異常表達對上皮間質轉化的轉錄因子和細胞因子進行上調作用[12,13]。在本文研究實驗中，對轉染E-cadherin后的細胞進行檢測，使用RT-PCR、Western blot方法進行檢測，結果顯示，兩種檢測均顯示HepG2-C1orf 61組細胞中E-cadherin表達均較高，此結果可能是由于C1orf 61通過誘導上皮間質轉化的即可能與對E-cadherin表達進行調控有關。E-cadherin為E-鈣黏蛋白，在上皮間質轉化中作為重要的標志分子存在[14-16]。E-cadherin的主要功能為對細胞間緊密連接的完整性進行維持，對細胞的侵襲、轉移進行抑制，但細胞中出現低表達的E-cadherin時會誘導上皮間質轉化的發生[17,18]。有研究表明，肝細胞生長因子會通過對Snail的誘導促進肝癌細胞發生上皮間質轉化的發生[19]。在本文研究中，對轉染后細胞中p-STAT3和p-Akt表達量進行檢測，結果顯示，HepG2-C1orf 61組p-STAT3、p-Akt蛋白相對表達量高于HepG2-NC組，此結果表明，C1orf 61能夠激活p-STAT3和p-Akt的表達，從而促進細胞的EMT和細胞遷移。通過p-STAT3和p-Akt的選擇性抑制劑及在基因水平持續性激活或抑制p-STAT3和p-Akt的活性，觀察細胞遷移能力的變化。結果表明，p-STAT3和p-Akt在C1orf 61誘導的細胞遷移中發揮了關鍵作用。而激活p-STAT3和p-Akt的活性是依賴NRP2受體進行的。隋承光等[20]在其研究實驗中認為過表達的miR100主要通過上調E-cadherin的表達，對上皮間質轉化進行抑制。在本文研究實驗中，對HepG2轉染后檢測細胞遷移能力，結果顯示，HepG2-C1orf 61組細胞遷移能力顯著高于空載體組，且E-cadherin表達較高，此結果提示，C1orf 61促進肝細胞肝癌細胞遷移的機制可能與E-cadherin的表達有關。但目前臨床上對于C1orf 61通過激活p-STAT3、p-Akt的表達來作用于E-cadherin促進肝細胞肝癌細胞遷移的研究較少，仍需進一步研究驗證。

綜上所述，C1orf 61可促進肝細胞肝癌的遷移，其作用機制可能為C1orf 61激活p-STAT3和p-Akt的表達后，促進肝細胞肝癌細胞的EMT，進而促進細胞遷移。