新疆維吾爾族、漢族膠質母細胞瘤基因表達差異臨床研究

張誠，丁建玲，吳永剛，買買提依明·托合提，董軍，王繼超，楊小朋

(新疆維吾爾自治區人民醫院神經外科，新疆 烏魯木齊)

0 引言

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，又以WHO Ⅲ級及Ⅳ級高級別膠質瘤最為多見，Ⅳ級膠質母細胞瘤術后平均生存期約為14個月左右[1]。Ⅲ級、Ⅳ級膠質瘤預后不佳，生存期短，目前已成為治療一大難題。

膠質瘤目前的治療策略仍以外科手術為主[2]，術后給予同步放化療等綜合治療。由于膠質瘤具有浸潤性生長特性、易局部擴散、容易復發、難治性等特點[3]，嚴重影響患者的治療效果及預后；尤其膠質母細胞瘤現階段仍無有效治療措施，大多數患者術后短期復發、預后不佳、死亡率較高。

近些年來，隨著對膠質瘤分子病理的不斷深入研究，人們逐漸意識到膠質瘤的發生和發展或許與多個遺傳因素改變有關，例如基因突變、變異、缺失等。隨著分子病理學不斷發展及多個腫瘤分子標記物被重視并深入研究，初步了解了膠質瘤基因表達差異與預后有關。

目前新疆學者已有大量研究表明，新疆維吾爾族婦女為乳腺癌、宮頸癌的高發人群，其發病率、發病特點與漢族婦女相比有著顯著性差異。本文通過對新疆維吾爾族及漢族膠質母細胞瘤患者的回顧性研究，初步探討新疆維吾爾族、漢族腦膠質母細胞瘤患者在MGMT 、1p19q、IDH、P53 基因表達的差異性。

1 資料與方法

1.1 標本

選取新疆維吾爾自治區人民醫院神經外科2018 年1 月至2019 年11 月共50 例膠質瘤母細胞瘤患者，倫理經新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會批準，所有患者手術均經我科高年資神經外科醫師完成，術后病理證實膠質母細胞瘤(見圖5)，同時術后立即將患者部分新鮮腫瘤組織標本送至新疆維吾爾自治區人民醫院精準醫學中心進行分子病理學檢測。

本組病例共有膠質母細胞瘤患者50 例，其中男性21 例，女性29 例；年齡25-70 歲；其中漢族24 例、維吾爾族17 例、其他民族9 例。

1.2 方法

MGMT：焦磷酸測序和甲基化定性PCR 分析法檢測MGMT 基因啟動子甲基化(見圖1)。

IDH1：IDH1 基因突變采用PCR 分析法測序(見圖2)。

1p19q：1p19q 缺失采用熒光PCR 毛細管電泳法(見圖3)。

P53：免疫組化SP 染色(見圖4)。

1.3 結果判定

MGMT 甲基化結果判定：(1)甲基化引物有擴增而非甲基化引物無擴增，則該樣品為完全甲基化；如果甲基化引物有擴增而非甲基化引物也有擴增，則該樣品為部分甲基化，仍視為甲基化陽性；(2)如果甲基化引物無擴增而非甲基化引物有擴增，則該樣品為無甲基化(圖1)。

IDH 結果判定：將PCR 測序得到的序列與IDH1/2 的原始序列進行對比，分析特定的堿基位置是否發生突變(圖2)。

1p/19q 缺失結果判定：觀察組織各STR 位點峰圖情況并與外周血各STR 位點峰圖比較，主峰消失或者峰值減少50%以上判為該STR 位點存在缺失(圖3)。

P53：SP 免疫組化染色下陽性產物通常為棕色顆粒，p53 陽性為細胞核出現黃染，對切片中出現染色反應的細胞進行計數，陽性判斷標準為染色細胞數量超過10%(圖4)。

1.4 統計學分析

采用SPSS 16.0 統計學軟件對相關數據進行統計學分析，檢驗水準α=0.05，采用檢驗，P＜0.05 具有統計學意義。

2 結果

2.1 MGMT、1p19q、IDH、P53 在不同臨床特點膠質母細胞瘤患者中的表達情況

50 例膠質母細胞瘤患者其中男性21 例(42%)、女性29例(58%)，≤50 歲患者24 例(48%)、＞50 歲患者26 例(52%)、漢族患者24 例(48%)、維吾爾族患者17 例(34%)、其他民族9 例(18%)；MGMT 甲基化陽性患者41 例(82%)、1p19q 缺失患者15 例(30%)，IDH 突變患者18 例(36%)。

2.2 MGMT、1p19q、IDH、P53 表達之間相互關系

MGMT、1p19q、IDH、P53 之間的相互表達通過χ2檢驗分析，如表2 所示，MGMT、1p19q、IDH、P53 相互之間表達無統計學意義，P＞0.05，說明各分子病理基因表達之間無協同相關性。

3 討論

3.1 MGMT

甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶(MGMT)是一種DNA 修復蛋白，正常狀態下可以將DNA 上的鳥嘌呤O6 位點移除，使鳥嘌呤恢復正常，起到保護細胞、避免損傷的作用。目前用于腫瘤治療的烷化劑主要有：替莫唑胺(TMZ)、嘧啶亞硝脲(ACNU)、雙氯乙基亞硝脲(BCNU)等。TMZ、ACNU、BCNU 均作用于O6 位點的鳥嘌呤，而MGMT 能夠迅速移除O6 位點鳥嘌呤上的烷基化合物致使烷化劑殺腫瘤作用下降，從而導致腫瘤耐藥[4]。已有大量研究表明MGMT 活性降低能使膠質瘤患者細胞對烷化劑藥物敏感性增強，隨后研究證實膠質瘤中活性降低的最主要原因為MGMT 基因啟動子區-CpG 島甲基化。MGMT 甲基化的膠質瘤患者對烷化劑藥物雙氯乙基亞硝脲和替莫唑胺更為敏感，同時MGMT 甲基化的膠質瘤患者的總生存率明顯提高，患者有效生存期與MGMT 啟動子甲基化狀態呈正相關關系[5]。

表1 MGMT、1p/19q、IDH、P53 表達與膠質瘤患者之間的單因素分析

表2 MGMT、1p19q、IDH、P53 之間相互關系

圖1 MGMT 結果：A.MGMT 陰性表達，B.MGMT 陽性表達

圖2 雜合395G/A IDH1 突變：箭頭顯示IDH1 基因密碼子132 CGT/CAT 雜合突變

圖3 1p19q 熒光PCR 結果

圖4 P53 結果：超過30%的細胞顯示出核陽性

圖5 膠質母細胞瘤病理圖片：A.病理常規圖片 B.免疫組化圖片

研究發現，具有MGMT 甲基化的膠質瘤患者對放療和化療更敏感，并且具有更長的生存期。所有，MGMT 甲基化可作為主要預后標記，還可以提示后期化療效果。本研究MGMT 甲基化患者共41 例(82%)，其中漢 族20 例(40%)、維吾 爾族13 例(26%)、其他民族8 例(16%)，如表1 所示，MGMT 在不同民族、不同性別、不同年齡各組中表達無差異性，雖然MGMT 甲基化為膠質瘤患者預后良好的指標，但MGMT 甲基化在新疆維吾爾族、漢族膠質母細胞瘤患者中表達無明顯差異性，說明在新疆維吾爾族和漢族在膠質母細胞瘤發生發展過程一致、無差異性。

3.2 1p19q

現有研究表明少突膠質細胞瘤特征性表現為1p19q 聯合缺失，且1p19q 為少突膠質細胞瘤主要分子標志物[6]。1p19q 缺失為1 號染色體短臂(1p)和19 號染色體長臂(19q)上發生的雜合性缺失。1p19q 聯合性缺失主要發生于少突膠質細胞瘤，其中發生率為80-90%，在間變性少突膠質瘤細胞中約50-70%，在彌漫星形膠質細胞瘤中發生率約為15%，在膠質母細胞瘤中發生率約為5%。在鑒別少突膠質細胞瘤和混合性少突星型細胞瘤時，都應進行1p19q 聯合缺失檢測，從而有助于區分混合性膠質瘤傾向于星型還是少突，這對于后續治療有指導意義。1p19q 雜合性缺失檢測可用于指導少突膠質細胞瘤以及少突星型膠質細胞瘤患者的個體化治療。含1p19q 聯合性缺失的患者對PCV 化療方案更為敏感，并且預后比較好；反之，患者對PCV 化療敏感性不高，并且預后較差[7]。

有研究表明[8]，可將lp19q 聯合缺失作為一項獨立預后影響因子，該研究同時還表明在復發膠質瘤患者當中，lp19q 聯合缺失患者也具有比較好的預后。因此可將1p19q 聯合缺失作為判斷放化療敏感性及患者預后的重要指標。本組研究中1p19q 聯合性缺失患者為15 例，聯合性缺失患者占總患者30%，1p19q 缺失目前主要用于少突膠質細胞瘤，但目前研究表明1p19q 聯合性缺失對膠質母細胞瘤患者的預后也有一定指導意義；但本組研究中新疆漢族與維吾爾族1p19q 聯合缺失率分析中表達無差異性、無統計學意義。

3.3 IDH

異檸檬酸脫氫酶(IsocitrateDehydrogenase，IDH)為新陳代謝過程中的一種關鍵酶。IDHl/IDH2 基因突變導致IDH 催化異檸檬酸氧化脫羧成為α-酮戊二酸的能力喪失，同時使IDH 獲得了依賴NADPH 催化還原α 一酮戊二酸(α-KG)為2 羥基戊二酸(2HG)的能力。IDHl/IDH2 突變造成細胞中2HG 的蓄積，過量的2HG可以直接抑制TET2 依賴α-KG 催化5-甲基胞嘧啶生成5-羥甲基胞嘧啶的能力，這是導致細胞具有過度甲基化表型的原因之一，從而影響腫瘤的發展[9]。已有相關研究表明，約12%的膠質瘤患者存在IDH1 基因突變，且與腫瘤發生相關，故可將IDH1/IDH2 基因突變做為預后良好的重要標志，大量研究表明，IDH1/IDH2 基因突變患者較野生型基因患者預后好[10]。

IDH1/IDH2 基因突變對腦膠質瘤患者的診斷和預后具有指導意義。表明膠質瘤的發生、發展及預后與IDH1 突變具有相關性，隨后大量研究也證實IDH1 突變在膠質瘤中具有普遍性。本研究中IDH 突變患者為18 例，突變率為36%，高于文獻報道，經統計學分析IDH 突變率在新疆維吾爾族及漢族中的表達無統計學意義、P＞0.05。雖然IDH1/IDH2 突變對Ⅲ級星形細胞瘤及膠質母細胞瘤患者的預后有很強的預測價值[11]，但在新疆漢族與維吾爾族之間表達無差異性。

3.4 P53

P53 基因突變與膠質瘤的發生、發展有相關性，P53 基因同時也是迄今為止研究最廣泛、與人類腫瘤關系最密切的抑癌基因。目前多項研究表明，p53 的表達在高級別膠質瘤中明顯高于低級別膠質瘤[15-16]。P53 基因突變不僅在膠質母細胞瘤的發生、發展過程中發揮作用，同時還會降低膠質母細胞瘤對放化療的敏感性。Wang 等[17]研究發現P53 基因突變降低同時可降低MGMT mRNA 的表達，使膠質母細胞瘤細胞對替莫唑胺的敏感性增強了5 倍。有研究表明，同時測定 MGMT 與P53 的表達有助于確定膠質瘤患者對替莫唑胺是否敏感[18]，在本研究中如表2 所示，MGMT與P53 表達無相關性，與相關研究不相符。同時如表1 所示本研究中P53 表達在新疆維吾爾族及漢族群體中表達無明顯差異。

3.5 MGMT、1p19q、IDH、P53 表達之間相互關系

研究表明通過對MGMT、1p19q、IDH、P53 聯合檢測，可將膠質瘤分為若干分子亞型[12]，通過對不同亞型的判斷，從而制定個體化治療方案，可使膠質瘤患者的生存率及預后率不斷提高，因此聯合檢測MGMT 、1p/19q、IDH 對高級別膠質瘤的診斷、治療及預后判斷均有一定參考價值[13]。但在本研究中，通過統計學分析，MGMT、1p19q、IDH、P53 相互表達之間無明顯相關性、無統計學差異。

4 展望

膠質瘤的發生、發展過程涉及了很多基因水平的改變，是多基因、多因素共同作用的結果，目前尚無單一、特定的某一種分子標志物可以單獨判斷患者預后，聯合檢測膠質瘤多個分子標記物將有助于提高判斷率及診斷率，這對高級別膠質瘤的診斷、治療及預后具有重要意義。

但本研究發現新疆漢族、維吾爾族在MGMT、1p19q、IDH、P53 表達方面無統計學差異，表明新疆維吾爾族、漢族不同民族在膠質母細胞瘤發生、發展及分子病理表達方面無明顯差異，故不可將MGMT、1p19q、IDH、P53 聯合檢測用于鑒別新疆不同民族之間表達差異，但可用于膠質瘤預后指標。本研究也存在諸多不足，如單中心、樣本量較少、檢測指標較少、隨訪時間較短等，導致本實驗研究結果表明新疆漢族、維吾爾族膠質瘤母細胞瘤表達之間無差異性，在隨后的研究中我們將不斷進行實驗補充、驗證試驗結果。