腫瘤壞死因子受體相關因子6的表達對食管鱗狀細胞癌預后的影響

楊蘭艷，殷芳，王建剛，孔娜

作者單位：云南省第三人民醫(yī)院消化內科，云南 昆明650000

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤，其預后不良，居全球癌癥相關死因第6位［1］。西方國家大多數食管癌病理類型為腺癌，而在我國則以鱗狀細胞癌居多。隨著以手術治療為主、化療和放療為輔的綜合治療措施的出現，食管癌病人的生存率有所提高，但其5年總生存率仍然較低［2］。腫瘤壞死因子受體相關因子6（Tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）是一種新型天冬酰胺基內肽酶蛋白酶，具有促進蛋白質穩(wěn)定的作用［3］，最近的研究表明TRAF6與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關［4-6］。然而國內尚未發(fā)現TRAF6與食管鱗狀細胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）復發(fā)和生存的相關性研究。本研究通過檢測TRAF6在ESCC組織中的表達及其與生存和復發(fā)的相關性，以期為ESCC的治療和預后評估提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2012年12月至2014年2月在云南省第三人民醫(yī)院接受根治性切除術治療的經病理證實為ESCC的病人作為研究對象。共有478例ESCC病人納入本研究，年齡（59.3±7.6）歲，年齡范圍為44～75歲。本研究符合《世界醫(yī)學協會赫爾辛基宣言》相關要求，所有研究對象在參與本研究前均已簽署知情同意書。

1.2免疫組織化學及陽性判斷標準采用10%甲醛對術中切除的新鮮的食管癌組織標本進行固定，并行常規(guī)石蠟包埋，將石蠟標本切成4 μm連續(xù)切片，60℃烤片8 h備用。將切片脫蠟和水化。采用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，每次3 min。蒸餾水浸泡后行抗原修復。采用PBS 100℃修復10 min。并自然冷卻至室溫。在PBS搖床上進行2～3次沖洗，每次5 min。然后滴入過氧化氫酶阻斷溶液，室溫下孵育10 min；滴加生物素標記二抗（羊抗兔IgG），室溫下孵育1 h；PBS沖洗3次，每次3 min；行DNA染色，蒸餾水沖洗后，使用蘇木素復染，酒精脫水，采用流水進行緩慢沖洗反藍，空氣干燥，中性膠封片。

由2名高級職稱病理科醫(yī)師對免疫結果進行判定［7］：在高倍鏡下，每張切片觀察15個視野。平均100個細胞中TRAF6陽性細胞的個數為陽性細胞率。細胞質中觀察到棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞染色程度評分標準為0分：陰性；1分：淡黃色；2分：黃色；3分：棕黃色。陽性細胞百分比評分標準：0分：＜1%；1分：1%～10%；2分：＞10%～30%；3分：＞30%～60%；4分：＞60%。最終得分為細胞質陽性細胞染色程度評分與陽性細胞百分比評分之和。最終結果判定：0～2分：陰性，3～7分：陽性。

1.3隨訪采用電話隨訪和門診隨訪相結合的方式，病人出院后每3個月隨訪1次，了解病人術后復發(fā)和生存狀況等信息，隨訪截止日期為2019年5月。478例ESCC病人中，445例完成隨訪，失訪23例，隨訪率95.2%。中位隨訪時間為33個月（范圍為5～60個月）。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。連續(xù)資料用x±s表示。分類資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。用Kaplan-Meier并Log-rank檢驗進行單因素生存分析，單因素分析差異有統(tǒng)計學意義的變量納入Cox多因素模型分析影響ESCC病人復發(fā)和死亡的獨立危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1TRAF6表達與ESCC病人臨床病例特征的關系478例ESCC病人中，341例（71.3%）符合TRAF6表達陽性標準。TRAF6陽性表達癌組織細胞質呈淡黃色、棕黃色或棕褐色，見圖1。TRAF6表達與性別、年齡、腫瘤大小無關（P＞0.05）。TRAF6表達與ESCC病人的TNM分期、淋巴結轉移、復發(fā)和死亡狀況顯著相關（P＜0.001）。淋巴結轉移、較高臨床分期、發(fā)生復發(fā)或死亡的病人TRAF6陽性表達率高。見表1。

表1 腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）表達與食管鱗狀細胞癌臨床病例特征的關系/例（%）

2.2ESCC病人單因素生存分析Kaplan-Meier并Log-rank檢驗顯示，較高TNM分期、淋巴結轉移、TRAF6陽性表達可增加ESCC病人復發(fā)風險（P＜0.001）。較高TNM分期、淋巴結轉移、復發(fā)、TRAF6陽性表達可增加ESCC病人死亡風險（P＜0.001）。結果見表2，圖2。

2.3ESCC病人多因素Cox回歸分析結果將Kaplan-Meier并Log-rank分析結果顯示差異有統(tǒng)計學意義的變量納入Cox回歸模型，結果顯示：較高TNM分期、淋巴結轉移、TRAF6陽性表達是ESCC病人復發(fā)的獨立危險因素（P＜0.001）。較高TNM分期、淋巴結轉移、復發(fā)、TRAF6陽性表達是ESCC病人死亡的獨立危險因素（P＜0.001）。見表3。

表2 食管鱗狀細胞癌445例單因素生存分析

表3 食管鱗狀細胞癌445例多因素生存分析

3 討論

近年來，雖然ESCC的治療技術取得了突破性的進展，然而其總體生存率并沒有得到顯著改善。ESCC具有家族聚集性的臨床特征，表明遺傳易感性可能在食管癌發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用［8］。然而，由于腫瘤的異質性，具有相似臨床特征的ESCC病人預后也可能不同。因此，鑒定新的敏感和特異性分子標志物對于ESCC的早期診斷和治療非常重要。TRAF6是腫瘤壞死因子受體和白細胞介素-1受體/Toll樣受體超家族誘導信號的銜接因子，并在先天免疫反應中發(fā)揮關鍵作用［9］。動物試驗發(fā)現TRAF6在ESCC細胞系中表達上調，并可調節(jié)細胞生長［10-11］。然而，TRAF6對ESCC病人復發(fā)和死亡影響的研究仍然有限。

本研究發(fā)現TRAF6陽性表達和ESCC病人的性別、年齡、腫瘤大小無關，但與ESCC病人的TNM分期、淋巴結轉移、復發(fā)和死亡狀況顯著相關。TRAF6陽性表達陽性病人復發(fā)和死亡的風險增加。這與先前關于TRAF6對其他腫瘤病人預后影響的研究一致：TRAF6高表達與胃癌、舌癌、卵巢癌等腫瘤的不良預后相關［4-5，12］。表明TRAF6可能是ESCC復發(fā)和死亡的新型生物標志物。TRAF6可以同時調控核因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）兩條信號通路。通過調控食管癌組織中NF-κB、MAPK兩條信號通路的異常激活，NF-κB轉錄活性的升高，可以增加食管癌化療的耐藥抵抗。MAPK家族主要包括細胞外信號調控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、JNK/SAPK（c-Jun氨基末端激酶/應激活化蛋白激酶）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）3個信號通路。ERK和p38 MAPK均在食管癌組織中存在高表達，并影響食管癌病人的預后［13］。JNK/SAPK磷酸化后可促進食管癌組織中瘤體的生長和血管的形成，抑制JNK/SAPK的活性可抑制食管癌侵襲［14-15］。此外，抑制TRAF6的表達可顯著抑制多種腫瘤細胞的增殖和侵襲，并促進細胞周期的凋亡［13，16-18］。提示TRAF6可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的病理生理學作用。

綜上所述，TRAF6在ESCC癌組織中的表達參與ESCC的發(fā)生發(fā)展，TRAF6表達陽性病人復發(fā)和死亡的風險增加，TRAF6可作為ESCC潛在的治療靶點。

（本文圖1，2見封3）

圖1 食管鱗狀細胞癌病人癌組織中腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）表達（免疫組織化學染色×200）：A為陽性；B為陰性

圖2 腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）表達與食管鱗狀細胞癌445例生存率的相關性：A為無瘤生存率；B為總體生存率