亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態性與同型半胱氨酸水平的相關性

唐慧榮，馬舉娟，陳瑞祥

作者單位：1云南省第三人民醫院藥劑科，云南 昆明650011；2大理大學藥學與化學學院，云南 大理671000

同型半胱氨酸（Hcy）水平升高是多種疾病發生的獨立危險因素。有研究表明，Hcy水平每升高5 mmol/L，缺血性心臟病的發生風險增加32%，Hcy水平每降低3 mmol/L，缺血性心臟病的發生風險降低16%［1］；Hcy≥16 mmol/L的腦卒中病人，其病死率和復發率是Hcy正常病人的1.47倍和1.31倍［2］。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是Hcy代謝途徑中的關鍵酶，它能夠催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，為Hcy再甲基化為甲硫氨酸提供甲基，并維持體內正常的Hcy水平。當MTHFR基因發生突變，可使體內MTHFR酶活性下降，Hcy發生再甲基化途徑受阻，造成Hcy在體內蓄積，進而引發高Hcy血癥［3］。MTHFR C677T是目前發現MTHFR最常見的突變位點［4］，存在CC、CT、TT三種基因型，有研究表明，TT基因型可增加高Hcy血癥的發病風險［5］。MTHFR C677T基因在不同國家、地區、民族的分布具有明顯差異：歐洲人群的T等位基因分布較多（24.5%～43.8%），亞洲居中（2.5%～36%），非洲最低（4.9%～9.1%）［6］。因此，通過研究不同地域人群MTHFR C677T基因多態性以及與Hcy水平的相關性，將有助于該地區人群在疾病發生前后采取有效的預防和治療措施。目前國內外關于MTHFR C677T基因多態性的地域分布以及與Hcy相關性的報道很多，但云南地區還未見有大數據的相關研究。本研究通過探討985例云南地區人群MTHFR C677T基因分布特征及其與Hcy水平的相關性，旨在為本地區人群預防和治療MTHFR C677T基因突變引起的高Hcy血癥及其相關疾病提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2018年1月至2019年3月就診于云南省第三人民醫院并進行MTHFR C677T基因檢測的985例漢族人群（包括住院病人559例、體檢人群426例）作為研究對象，病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

入選標準：在該院進行MTHFR C677T基因檢測并在云南省長期居住的漢族人群，研究個體間無血緣關系。排除標準：檢測Hcy水平前2周曾服用或目前正在服用葉酸、B族維生素類或復合維生素藥物的病人；合并腫瘤、肝、腎功能不全者；甲狀腺功能異常者。

1.2方法

1.2.1分組 將所有研究對象按照基因型分為CC、CT、TT三組進行分析，并按照年齡分為青年組（＜45歲）、中年組（45～60歲）與老年組（＞60歲）；由于高Hcy血癥的診斷目前還沒有統一標準，因此本研究按照Hcy水平分為正常組（5～10 mmol/L），臨界組（＞10～15 mmol/L），高Hcy組（＞15 mmol/L）。

1.2.2數據收集 本研究收集數據包括：①人口學數據：姓名、性別、年齡、體質量、民族、職業等；②既往病歷資料：包括家族史，既往病史及現病史，用藥情況（是否服用過葉酸、B族維生素類藥物）；③相關實驗室檢查：Hcy檢測結果。去除個人標識信息。

1.2.3MTHFR C677T基因多態性檢測

1.2.3.1樣本采集 要求受檢者清晨空腹狀態下（采血前一天晚餐后至第2天早上采血前禁食8～14 h），取坐位，采集肘靜脈血，約3～5 mL，加至EDTA抗凝管中，并充分混勻，避免凝血或溶血，立即放置于-20℃冰箱保存，用于測定MTHFR C677T基因多態性。

1.2.3.2全血DNA提取 實驗前準備：打開金屬浴，設置為56℃；從2～8℃冰箱中取出核酸提取試劑盒，向緩沖液BW1中加入5 mL無水乙醇、向緩沖液BW2中加入7 mL無水乙醇，并做標記。隨后進行①活化吸附柱、②裂解細胞、③洗滌。

洗脫獲得DNA：取1.5 mL離心管，將吸附柱插入其中，棄去裝廢液的收集管，向吸附柱膜中間位置懸空滴加60 mL洗脫液BE，蓋緊蓋子，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min（DNA樣本-20℃保存1個月，期間反復凍融不超過3次）。

1.2.3.3PCR-芯片雜交法檢測MTHFR C677T基因型 PCR擴增：-20℃冰箱中取出試劑（擴增液，反應液A）放置室溫，低速離心；將新開啟的擴增液進行冰上分裝（擴增液忌反復凍融）：取12個0.2 mL的PCR管，每管分裝22 mL，留用實驗所需數量的擴增液，其余放入-20℃冰箱保存（用于之后實驗按需取出相應數量分裝好的擴增液）；在PCR管蓋上進行樣本編號；在各擴增管中依次加入1 mL反應液A，2 mL提取好的DNA樣品溶液，混勻；將各擴增管放入PCR儀中，按下列條件進行擴增：50℃5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，35個循環；72℃ 5 min；取出擴增產物，2～8℃保存。

芯片雜交顯色：-20℃冰箱中取出反應液B，室溫解凍后，低速離心，取10 mL加入雜交緩沖液中，做好標記，在手中轉動混勻；-20℃冰箱中取出抗體和抗體稀釋劑，將抗體和抗體稀釋劑按照1∶3 000比例混勻，12 000 r/min離心30 s，取上清液使用；從雜交顯色試劑盒中取出所需數量的8聯管，在8聯管圓頭的側壁標注樣本編號并放置于試劑架上；吸取190 mL雜交緩沖液加入其中，再加入10 mL擴增液的擴增產物，吸打混勻；加入200 mL抗體；加入200 mL顯色液；-20℃冰箱中取出MTHFR基因芯片，將芯片與8聯管依次放入雜交儀中，加載雜交程序，進行雜交反應。

讀取結果：使用生物芯片識讀儀讀取結果。

1.3統計學方法運用SPSS 22.0軟件進行數據處理，定量資料不服從正態分布時采用中位數（下、上四分位數）［M（P25，P75）］描述。采用χ2檢驗進行各基因組性別、年齡頻率的比較，分析MTHFR C677T基因多態性與性別、年齡的相關性；采用Kruskal-Wallis秩和檢驗進行組間Hcy水平總體差異的比較，采用Games-Howell檢驗進行多組間的兩兩比較，分析MTHFR C677T基因多態性與Hcy水平的相關性；采用趨勢χ2檢驗比較不同組間基因型分布頻率隨Hcy水平分層變化的趨勢。P＜0.05認為差異有統計學意義。應用Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗方法檢測樣本的群體代表性，P＞0.05說明樣本人群該基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結果

2.1985例檢測人群MTHFR C677T基因分布特征MTHFR C677T中CT基因型分布頻率相對較高49.9%（492/985），CC基因型分布頻率相對較低19.6%（193/985），TT基因型分布頻率居中30.5%（300/985）。經檢驗，樣本人群符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2＝0.115，P＝0.944），具有群體代表性。

2.2不同性別MTHFR C677T基因分布特征男性CC、CT、TT基因型分布頻率與女性比較差異無統計學意義（χ2＝5.88，P＝0.053），見表1。

表1 不同性別漢族人群MTHFR C677T基因型頻數和頻率分布/例（%）

2.3不同年齡MTHFRC677T基因分布特征結果顯示三種基因型在不同年齡組中分布差異無統計學意義（χ2＝4.33，P＝0.363），見表2。

表2 不同年齡漢族人群MTHFR C677T基因型頻數和頻率分布/例（%）

2.4MTHFR C677T基因多態性與血漿Hcy相關性

2.4.1MTHFR C677T不同基因型血漿Hcy水平比較 Hcy檢出最高濃度為86.40 mmol/L，最低濃度為5.00 mmol/L，均為CT基因型。經正態性檢驗，血漿Hcy水平不服從正態分布，三種基因型Hcy濃度為13.50（5.55，21.45）mmol/L，CC、CT、TT基因型Hcy濃度分別為 12.30（6.73，17.87）mmol/L、12.68（7.20，18.16）mmol/L、19.04（4.11，42.19）mmol/L。經Kruskal-Wallis檢驗，不同基因型組間Hcy水平總體差異有統計學意義（H＝134.96，P＜0.001），采用Games-Howell檢驗進行組間兩兩比較，結果顯示，TT基因型的Hcy水平高于CC和CT（P＜0.001），CC和CT基因型的Hcy水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4.2Hcy水平不同分層中MTHFR C677T基因分布特征 CC、CT基因型在Hcy水平臨界組（＞10～15 mmol/L）中分布頻率相對較高，TT基因型在高Hcy組（Hcy＞15 mmol/L）中分布頻率相對較高，見表3。

表3 Hcy（同型半胱氨酸）水平不同分層中漢族人群MTHFR C677T基因分布特征/例（%）

3 討論

MTHFR是Hcy代謝的關鍵酶，MTHFR基因突變可改變體內MTHFR氨基酸結構，使MTHFR酶活性降低，導致Hcy再甲基化受阻，Hcy水平升高，進而引發高Hcy血癥。MTHFR C677T是MTHFR最常見的突變位點［4］，同時MTHFR C677T基因多態性也是乳腺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤的易感基因［7-9］，《中國高血壓防治指南2010》中將Hcy水平≥10 mmol/L列為心血管事件發生的獨立危險因素。

Frosst等［4］在1995年首次提出MTHFR核苷酸第677位胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）替換，導致第222位氨基酸由高度保守的丙氨酸變為纈氨酸，由此突變產生了CC、CT、TT三種基因型，研究表明CT基因型可使酶活性降低35%，TT基因型可使酶活性降低70%［10］。

本研究對985例云南地區人群MTHFR C677T基因多態性進行了分析，結果顯示CC型19.6%，CT型49.9%，TT型30.5%。與其他地區相比，CC基因型分布高于北方山東（14.6%）、河南（16.6%），低于天津（21.4%）、陜西（21.7%），且低于南方江蘇（32.7%）、湖北（36.2%）、四川（41.8%）、云南（42.7%）、廣東（51.3%）、海南（58.5%），TT基因型分布在北方地區高于天津和陜西（均為30.4%），低于山東（40.8%）、河南（37.0%），高于南方江蘇（19.7%）、湖北（16.8%）、四川（13.8%）、云南（15.3%）、廣東（8.3%）、海南（6.4%）［19］。上述結果表明985例云南地區人群MTHFR C677T基因多態性與其他地區相比存在地域差異性。此外，本研究中，與其他民族相比，漢族TT基因型（30.5%）分布頻率較高（布依族0.84%、苗族7.45%、回族3.42%、壯族0%、維吾爾族5.26%、蒙古族15.20%［11］），表明MTHFR C677T基因多態性分布具有民族差異性，以上結論與國內外相關報道結論一致［12-15］。

在不同性別方面，大部分研究結論認為MTHFR C677T基因多態性不存在性別差異［11，16］，但也有個別研究得出相反結論。如吳自強、徐韞健［17］研究結果顯示突變基因型CT、TT在女性中的分布頻率（38.7%，16.1%）均高于男性（30.2%，9.8%），（P＜0.05）。本研究中CC、CT、TT基因型分布頻率男性（67.4%，58.9%，65.7%）與女性（32.6%，41.1%，34.3%）差異無統計學意義（P＝0.053）。在不同年齡方面，本研究結果顯示：CC、CT、TT基因型在60歲及以上人群中分布頻率（47.2%，42.9%，50.0%）與在 45歲以下人群（12.9%，15.4%，14.0%）也差異無統計學意義（P＝0.363）。此結論與任瑋等［18］研究結論相一致。

MTHFR C677T基因突變引起的Hcy水平升高是目前最常見的遺傳因素之一，并且由MTHFR C677T基因突變引起的Hcy水平變化可增加疾病的發生風險。本研究對MTHFR C677T多態性與Hcy水平相關性進行分析，結果顯示：TT基因型的Hcy水平19.04（4.11，42.19）μmol/L較高，其次為CT基因型 12.68（7.20，18.16）μmol/L，CC 型 Hcy水平較低12.30（6.73，17.87）μmol/L，TT基因型與 CC、CT 型Hcy水平差異有統計學意義。進一步對Hcy水平進行分組，結果顯示：TT基因型在Hcy水平正常組（5～10 mmol/L）、臨界組（＞10～15 μmol/L）以及高Hcy組（Hcy＞15 μmol/L）中的分布頻率分別為 9.0%、27.3%、63.7%，TT基因型的分布頻率隨著Hcy水平的升高而增大。以上結果表明MTHFR C677T多態性與Hcy水平存在關聯，并且TT基因型可能是發生高Hcy血癥的危險因素，此結論也與國內外大部分相關研究結論一致［19-20］。