基于單層MoS2納米片的復合物制備及其光熱性能和體外藥物釋放

楊延波，謝曉田，張雪靜，鄭永利，朱利民

(東華大學 a. 化學化工與生物工程學院； b. 東華大學-倫敦都市大學中英藥用紡織品聯合實驗室，上海 201620)

二維過渡金屬二硫化物(TMDCs)納米材料由于其獨特的電子特性、高比表面積和高吸光度，引起學者的廣泛關注[1]。MoS2納米片作為TMDCs的典型代表，具有高NIR(近紅外，700～1 100 nm)吸光度和低毒性，成為下一代光熱轉換材料的最佳選擇[2]。特別是其組成元素Mo是細胞中幾種酶的必需微量元素，S是一種常見的生物元素[3]，因此MoS2是一種可用于生物醫學領域的出色材料。然而，由于MoS2的表面能較高，納米片在數量較多時往往不可避免地重新堆積和聚集，這極大地限制了其應用[3]。此外，目前制備的MoS2納米片的膠體穩定性不理想[4-7]，而這對于生物醫學領域的應用至關重要。因此，基于MoS2的靶向藥物遞送系統的應用受到限制。

在前期的研究工作中發現，功能化的MoS2納米片可以將化學療法和光熱療法相互組合，從而用于靶向藥物遞送，但協同治療效果有待加強[8]。黑色素是人體內源性生物色素，具有固有的光學吸收能力，主要存在于皮膚、毛囊和眼睛中，基于黑色素的納米平臺在診斷成像和光熱療法中展現出巨大的前景。Zhang等[9]報道了一種基于黑色素(Mel)的納米脂質體診斷治療系統，其具有理想的光熱轉換效率、治療性能和生物安全性，可以實現乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤的完全根除。基于黑色素的納米粒子可用作光聲成像(PAI)和磁共振成像(MRI)的多功能造影劑，具有理想的生物安全性和較低的副作用。

本文基于單層MoS2納米片設計了一種納米復合物，其由聚乙烯亞胺(PEI)連接透明質酸(HA)，同時用聚乙二醇(SH-PEG)修飾MoS2納米片，最終制成HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG(簡稱HPMP)納米載體，其可用于遞送并在pH、NIR雙重刺激響應下釋放化療藥物鹽酸阿霉素(DOX)，將DOX和光熱劑MoS2、Mel相結合可應用于腫瘤的化療-光熱協同治療。

1 試驗部分

1.1 原材料及試劑

透明質酸(Mw=0.5 kDa)，購自天津希恩思奧普德科技有限公司；黑色素，購自北京科瑞邁科技有限公司；聚乙二醇(SH-PEG，Mw=2 kDa)，購自上海湃閣恩貿易經營部；聚乙烯亞胺、鹽酸阿霉素、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，購自阿拉丁生化科技股份有限公司；α-硫辛酸(LA)、己烷中的n-BuLi溶液(2.4 M)，購自阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈，購自上海凌峰化學試劑有限公司；磷酸緩沖鹽(PBS)溶液，購自Sigma-Aldrich；其他材料和透析袋均購自國藥集團化學試劑有限公司。試驗中所用的藥品均為分析純，試驗中所用的水均為Milli-Q Plus 185凈水系統純化所得超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 MoS2納米片的制備[10]

將0.3 g鉬酸鈉和0.6 g硫代乙酰胺分散在30 mL水中，超聲15 min后磁力攪拌至完全溶解。在220 ℃反應釜中反應24 h，反應結束后離心，用去離子水洗滌3次，冷凍干燥收集黑色沉淀物得到MoS2納米片。

1.2.2 PEI-LA-MoS2-SH-PEG(簡稱PMP)的制備[11]

將300 mg PEI溶解在超純水中，用稀鹽酸調節溶液的pH至中性，將82.4 mg LA溶解在20 mL乙腈溶液中，之后將191.7 mg EDC和115.1 mg NHS加入到溶解LA的乙腈溶液中，攪拌均勻后，加入到PEI溶液中攪拌過夜，然后將溶液透析、冷凍干燥得到LA-PEI。將30 mg LA-PEI加入到10 mL質量濃度為0.25 mg/mL的MoS2分散液中，超聲30 min后攪拌過夜，然后離心，用蒸餾水洗滌沉淀3次，透析、冷凍干燥得到PEI-LA-MoS2(PM)。取3 mL質量濃度為0.5 mg/mL的PEI-LA-MoS2溶液加入15 mg SH-PEG，超聲30 min，然后磁力攪拌12 h，制備得到PMP。

1.2.3 HPMP的制備

將30 mg HA溶解于15 mL超純水，再加入10 mL質量濃度為0.8 mg/mL的EDC溶液，超聲15 min，再分別加入10 mL質量濃度為1 mg/mL的EDC溶液、15 mL質量濃度為2 mg/mL且pH=8.5的NHS水溶液。將上述所制溶液在室溫下攪拌2 h，后加入15 mg PMP，攪拌過夜，然后離心，冷凍干燥得到HPMP。

1.2.4 HPMP的載藥能力和藥物釋放研究

將HPMP與模型藥物DOX按不同比例在pH=7.4的PBS溶液中混合，攪拌過夜。離心收集上層清液，通過紫外分光光度計測試其載藥能力。預試驗發現，當DOX與HPMP的質量比為1∶1時，載體的載藥能力最強，1 g HPMP能負載812.5 mg DOX。

將質量比為1∶1的HPMP與DOX在pH=7.4的PBS溶液中混合，攪拌過夜，離心凍干收集沉淀。稱取3 mg載藥載體分散在3 mL不同pH值的PBS溶液中，然后置于透析袋(截留相對分子質量為6 000)中透析，透析袋外部為50 mL對應pH值的PBS溶液，每間隔一定的時間取透析袋外部液體1 mL，測溶液在波長480 nm 處的紫外吸收并補充透析袋外部液體使之保持不變。載藥效率(η)按式(1)計算。

(1)

1.3 材料表征

使用日本JEOL公司的JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM)觀察制備的MoS2的形貌。使用美國布魯克海文儀器公司的BI-200 SM型靜態光散射儀對MoS2、 HPMP進行水動力學直徑(DLS)測試。使用美國Nicolet公司Nexus-670型傅里葉紅外光譜儀(FTIR)對PEI-LA-MoS2(簡稱PM)、PMP、HPMP進行測試分析，波數為600～4 000 cm-1，間隔為2 cm-1。使用英國的馬爾文Malvern Zetasizer Nano ZS 90型納米粒度電位儀對MoS2納米片、PM、 PMP、 HA和HPMP的Zeta電位變化進行測量。使用UV 3600型紫外可見分光光度計對載藥前后的HPMP以及DOX進行測試。

2 結果與討論

2.1 MoS2及其復合物的表征

2.1.1 TEM及DLS分析

將制備的MoS2納米片重新分散在水溶液中，超聲使其均勻分散，通過TEM觀察所制備的MoS2納米片的形狀，如圖1所示。從圖1中可觀察到均勻分散的MoS2片狀結構，平均粒徑為80 nm。這與DLS測試的MoS2水溶液的水動力學直徑一致，這個粒徑大小有利于腫瘤細胞通過內吞途徑對載藥納米復合物進行攝取[12]。

將SH-PEG修飾在單層MoS2納米片表面，進一步接枝PEI并用HA修飾以后，納米復合物的水動力學直徑從大約80 nm升高至104 nm左右，這一粒徑使得HPMP納米復合物的靜脈注射給藥或通過EPR(electron paramangnetic resonance)效應使得藥物被動積累在腫瘤部位成為可能[13]。

2.1.2 紅外光譜分析

采用壓片法對PM、 PMP、 HPMP進行紅外光譜分析，結果如圖2所示。從圖2可以看出，PM紅外譜圖的2 924 cm-1處有飽和C—H特征峰，這表明PEI分子成功接枝在MoS2納米片上，1 698 cm-1處有—CONH—特征峰，說明LA與PEI通過酰胺鍵成功連接。在PMP紅外譜圖中1 340、 1 096 cm-1處有CH3的對稱變形振動峰以及C—O鍵的伸縮振動峰，說明SH-PEG分子已成功修飾MoS2納米片。HPMP的紅外譜圖中3 283 cm-1處的特征峰歸因于HA中C—H鍵的伸縮振動峰。由此可見，材料HPMP已成功制備。

2.1.3 Zeta電位分析

MoS2納米片、PM、 PMP、 HA和HPMP的Zeta電位變化如圖3所示。由圖3可知，MoS2納米片的電勢是-24 mV，經LA-PEI修飾后，電勢從負值(-24 mV)變為了正值(+6 mV)，說明PM已經成功制備。然后用SH-PEG來修飾所制備的PM以改善納米復合物的膠體穩定性，電勢從正值(+6 mV)進一步變為負值(-14 mV)，說明SH-PEG已成功加載在納米復合物PM上，從而制成PMP。最后，用靶向分子透明質酸HA來修飾PMP，以使該藥物遞送系統具有主動靶向腫瘤部位的能力，PMP的電勢從-14 mV變為-23 mV，表明靶向分子HA已在其上成功聚合。

2.1.4 穩定性分析

將所制備的無SH-PEG修飾的PM和SH-PEG及HA修飾的HPMP分別配成20 mL水溶液(質量濃度為1 mg/mL)放置在室溫下，分別在1、 24 h后觀察兩種溶液的變化情況，如圖4所示。由圖4可以看出，放置1 h后，PM和HPMP溶液都沒有出現明顯的集聚現象，但經過24 h后，無SH-PEG修飾的PM溶液出現明顯的集聚現象，而經SH-PEG修飾的HPMP溶液分散均勻，顯示出更高的膠體穩定性，可以較好地分散在水中而無任何附聚。

2.2 納米復合物的光熱效果測試

2.2.1 加載黑色素的影響

載藥納米復合物HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG@DOX(簡稱HPMP@DOX)與黑色素按照5∶1的質量比混合，得到HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG@(DOX/Mel)(簡稱HPMP@DOX/Mel)，其和無黑色素的載體HPMP@DOX光熱效果的對比如圖5所示。由圖5可知，對于HPMP@DOX，在600 s內其水溶液(質量濃度為1 mg/mL，功率密度為1 W/cm2) 的溫度從25 ℃升高至44 ℃，而在相同條件下，加載黑色素的載體HPMP@DOX/Mel的溫度從25 ℃升高至56 ℃。由此表明，黑色素的加載顯著提高了納米復合材料的光熱效果，使其具有應用于腫瘤細胞化療-光熱治療協同治療的潛力。

2.2.2 質量濃度和暴露時間的影響

將不同質量濃度的HPMP@DOX/Mel復合物的懸浮液暴露于808 nm激光(功率密度為1.0 W/cm2)中，并將純凈水作為對照樣，試樣的光熱效果如圖6所示。由圖6可知，隨著質量濃度和暴露時間的增加，HPMP@DOX/Mel水分散體的溫度明顯升高，表明所制備的納米復合物的光熱效果具有濃度依賴性。當HPMP@DOX/Mel納米復合材料的質量濃度為0.8 mg/mL時，溶液溫度可在300 s內達到52 ℃，從而證實HPMP@DOX/Mel納米復合材料具有良好的光熱效果。

2.2.3 激光照射強度的影響

HPMP@DOX/Mel質量濃度為1.0 mg/mL時，不同激光照射強度下的光熱效果如圖7所示。由圖7可知，相同質量濃度下，激光照射強度越大，溫度升高幅度越大。當激光照射功率密度為0.5 W/cm2時，300 s內HPMP@DOX/Mel水溶液的溫度從25 ℃升高至35 ℃；而當激光照射功率密度為1.5 W/cm2時，300 s內其水溶液的溫度從25 ℃升高至68 ℃。由此表明，所制備的納米復合物HPMP@DOX/Mel的光熱效果具有激光功率依賴性。

2.2.4 NIR激光循環的影響

在NIR激光照射下，4次開、關循環對HPMP@DOX/Mel溶液溫度的影響如圖8所示，其中，NIR激光照射功率密度為1.0 W/cm2，HPMP@DOX/Mel質量濃度為1.0 mg/mL，體積為1 mL。

由圖8可知，經過4次循環后，在溫度-時間曲線中未觀察到明顯的溫度衰減，這意味著HPMP@DOX/Mel納米復合材料具有優異的光熱穩定性，適用于腫瘤的光熱消融。

2.3 HPMP的載藥及體外藥物釋放研究

2.3.1 紫外光譜分析

對載藥前后載體HPMP和DOX的紫外光譜進行分析，結果如圖9所示。由圖9可知，單獨的阿霉素DOX在480 nm處有明顯的吸收峰，而載藥后的納米復合物HPMP@DOX的紫外吸收光譜在480 nm處也出現了明顯的吸收峰。由此表明，化療藥物阿霉素DOX已成功加載于納米復合物HPMP上。

2.3.2 藥物的體外釋放測試

在pH值為7.4的條件下研究了DOX與HPMP藥物上載的最佳質量比，結果如表1所示。由表1可知，最大載藥效率為81.25%，即當納米復合材料HPMP與DOX以1∶1的質量比混合時，載藥效率達到最大值，在1 g HPMP上可負載約812.5 mg DOX。

表1 與DOX以不同比例混合的HPMP的載藥量

在有無NIR激光照射和不同pH值的PBS溶液中，研究體外控制的藥物釋放隨時間的變化，結果如圖10所示，其中，NIR激光照射功率密度為1.5 W/cm2，波長為808 nm。

由圖10可知，藥物釋放1 h后，在pH值為7.4、沒有NIR激光照射時，從HPMP@DOX中釋放的DOX小于5%。然而，在pH值為5.0且沒有NIR激光照射時，1 h后DOX的釋放超過12%。這可能歸因于在弱酸性條件下DOX與納米復合材料HPMP的相互作用的減少，包括疏水相互作用和靜電相互作用，因此可以顯著加速DOX的釋放。在pH值為5.0且沒有NIR激光照射的情況下，6 h內釋放約24.8%的DOX。當存在NIR激光照射時，DOX釋放得更快，其在pH值為5.0時，6 h內釋放量增加至31.6%。由此可見，NIR激光觸發的光熱效應可以促進DOX的釋放，這可能歸因于MoS2納米片產生的高溫引起HPMP納米復合材料的振動，從而減少了DOX與之的相互作用。由于激光照射可以精確調節，因此pH/NIR多刺激響應的HPMP@DOX可以應用于癌癥的“按需”化療。

3 結 語

本文對單層MoS2進行修飾，在MoS2表面接枝了含有巰基的聚乙二醇，以聚乙烯亞胺為連接臂接枝透明質酸，使其獲得更好的穩定性、pH和近紅外光雙重刺激響應性。此外，選用鹽酸阿霉素作為模型藥物研究了具有雙重響應性的HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG的體外藥物釋放行為，結果顯示：這種雙重響應性MoS2復合物在模擬腫瘤的弱酸性(pH≈5.0)環境下，擁有顯著增加的藥物釋放速率；在近紅外光的激光照射下也表現出更快的釋藥速率，表明載體具有較好的控釋效果。此外，載體表面新型的光熱劑黑色素的負載顯著提高了納米復合材料的光熱效果，表明其有應用于生物醫學領域以進行化療光熱協同治療的潛在價值。