魔芋葡甘聚糖及氧化魔芋葡甘聚糖對益生菌生長及乳糖代謝作用的體外研究

蘆雨佳,毛凱雯,鐘 耕

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400716;2.西南大學西塔學院,重慶 400715;3.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(西南大學),重慶 400716)

乳制品是改善居民膳食結構,提高民族身體素質的重要食品,乳糖(lactose)是乳制品中存在的主要碳水化合物,乳糖經由小腸黏膜上皮細胞絨毛刷狀緣分泌的乳糖酶分解為葡萄糖和半乳糖,是供給嬰兒所需能量的主要來源[1]。據調查,全世界大約70%的人體內缺乏乳糖酶[2]。乳糖不耐受(lactose intolerance,LI)是由于乳糖酶數量的減少及活性的降低,不能完全消化分解乳中的乳糖而引起以腹脹、腹瀉、腹痛為主的一系列臨床癥狀[3]。乳糖不耐受按照病因主要分為三型,第一型為先天性乳糖不耐受,很罕見[4],不作為本文主要研究問題。第二型為原發性(成人型)乳糖不耐受,在臨床最為常見,是指隨著年齡增長乳糖酶活性自發地逐漸下降而引起的乳糖不耐受[5]。第三型為繼發性乳糖不耐受,指多由于感染性腹瀉、營養不良等原因,導致小腸粘膜細胞受損而使乳糖酶含量降低,從而對乳糖暫時不耐受[4]?，F如今關于解決乳糖不耐受問題的方法,均還有待完善。如食用低(無)乳糖制品,但無法長期滿足患者營養需求[6];口服乳糖酶通常需要長期治療且價格昂貴,且胃內pH等因素均會影響乳糖酶的功效[7];而改變基因又相對復雜且技術不成熟,仍處于試驗階段[8]。如何簡單高效地提高乳糖酶活性是現如今需要研究的主要方向。

人體腸道內乳糖酶的主要來源為機體自身合成、有益菌少量合成并分泌,以及攝入外源乳糖酶[9]。乳酸菌作為一種主要的腸道益生菌,能夠壓制腐敗細菌以及腸的腐化,預防便秘和老年性疾病,同時可以防治與抗生素有關的腹瀉[10]。其中,雙歧桿菌能夠改善乳糖的利用,并通過調節腸道菌群平衡來治療腹瀉[11]。另有研究表明,所有雙歧桿菌均具有乳糖酶,且活力顯著高于其他腸道菌群[9],因此適量補充雙歧桿菌可預防乳糖不耐受病癥的發生[12]。如何促進益生菌群的生長,成為提高乳糖酶活性及數量,從而緩解乳糖不耐受問題的新思路。

魔芋中的主要成分為一種可溶性半纖維素,即魔芋葡甘聚糖(Konjac Glucomannan,KGM)[13]。KGM是一種不被人體吸收的膳食纖維,具有極低的熱量及飽腹感,可以預防肥胖,并具備降血脂的作用[14-15]。有研究指出,KGM可促進乳酸菌等腸道益生菌的生長[16]。另有研究表明,RP-G28(一種特殊的低聚半乳糖)可能是改善乳糖消化和LI癥狀的有效方法[17],RP-G28與KGM均為水溶性膳食纖維,但未見有關KGM對乳糖代謝作用的研究。本實驗參考秦清娟等[16]通過腸道內容物體外厭氧發酵模擬腸道的方法,擬通過提供厭氧條件并調節發酵液pH為7.5左右模擬腸道環境[18]。以KGM及其氧化衍生物-氧化魔芋葡甘聚糖(Oligo-Konjacglucomannan,OKGM)為試驗材料,體外發酵法研究其對乳糖的降解作用。通過體外厭氧發酵24 h,從構效(KGM與OKGM)、量效(設置低、中、高劑量)以及時效(不同發酵時間的測定結果)三個方面測定并分析各指標,研究KGM和OKGM對益生菌生長和對乳糖代謝的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級KM小鼠 重慶騰鑫生物技術有限公司,SCXK(軍)2012-0011;KGM 重慶康家客食品公司,符合NY/T 494-2010《魔芋粉》;全脂奶粉 雀巢公司生產,配方:生牛乳、乳粉、鐵(焦磷酸鐵)、維生素D(膽鈣化醇)、食品添加劑(磷脂);乳酸菌種 北京川秀科技有限公司提供,丹麥進口,產品標準號:Q/TZCXG 0001;乳糖 合肥博美生物科技有限責任公司;碳酸氫銨、氯化鈉 成都市科隆化學品有限公司;碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、氫氧化鈉、九水合硫化鈉、亞硫酸氫鈉水 成都市科龍化工試劑廠;苦味酸 BR,臺山市眾城化工有限公司;上述試劑除注明外,均為AR;MRS培養基 BR,北京奧博星生物技術有限責任公司;多胨 BR,青島高科園海博生物技術有限公司;瓊脂 BR,福建省綠麒食品膠體有限公司;乳糖酶試劑盒 南京建成生物工程研究所;BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

Synergy H1多功能酶標儀 中國香港基因有限公司;Spectrum100紅外分光光度計 美國PERKINELMER公司;UV-2450紫外可見光分光光度計 日本SHIMADZU公司;JM-65003電子天平 中國諸暨市超澤衡器設備有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺 中國蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;GR60DA自動壓力蒸汽滅菌器 中國致微(廈門)儀器有限公司;NDJ-5S旋轉粘度計 中國上海越平科學儀器有限公司。

1.2.1 OKGM的制備 參考李斌等[19]的方法,并略有修改:將料液比為1∶4的KGM及異丙醇加入至三口瓶(500 mL)中,攪拌5 min,調pH7.5,反應溫度4～5 ℃,滴加體積分數為2.4%的H2O2,30 min內滴加完畢,反應4 h后,經過濾、洗滌,60 ℃低溫干燥至恒重,得OKGM。在60 ℃水浴加熱攪拌2 h,冷卻至室溫,用旋轉粘度計,檢測質量分數為1%的OKGM粘度為1036 mPa·s,質量分數為1%的KGM的粘度為7450 mPa·s。通過滴定法測定氧化度為0.431。分別稱取10 mg KGM和OKGM,以KBr壓片,傅里葉紅外分光光度計上測定,進行光譜分析。

1.2.2 體外厭氧發酵 基礎發酵液的配制參考Menke等[20]的方法,配方如下:400 mL H2O、0.1 mL微量元素溶液A(每100 mL溶液A含CaCl2·2H2O 13.2 g、MnCl2·4H2O 10 g、CoCl·6H2O 1 g和FeCl3·6H2O 8 g)、200 mL 碳酸鹽緩沖溶液B(每L溶液B 含NH4HCO34 g和NaHCO335 g)、200 mL 磷酸鹽緩沖溶液C(每L溶液C含Na2HPO45.7 g、KH2PO46.2 g和MgSO4·7H2O 0.6 g)、1 mL 1.0 g/L刃天青溶液、40 mL還原劑溶液(每100 mL還原劑溶液含NaOH 160 mg、Na2S·9H2O 625 mg)。

參考秦清娟等[16]方法,并作適當調整:在無菌條件下,分別取20只健康KM小鼠回腸、盲腸內容物,迅速裝入已滅菌處理的50 mL的帶蓋離心管中并稱重,導入高純二氧化碳,上蓋。加入內容物質量9倍的無菌生理鹽水稀釋,經振蕩分散均勻后用2層紗布過濾,即為回腸及盲腸內容物稀釋液。配制基礎發酵液,滅菌,等分為16份于各發酵瓶中(160 mL/份),其中12份分別加入不同劑量的KGM或OKGM以及奶粉,另外2份加入乳酸菌和奶粉作為陽性對照組,最后2份只添加奶粉作為陰性對照組(詳見表1)。迅速將體積分數10%回腸或盲腸內容物稀釋液加入上述各組發酵液中,混合均勻后沖入CO25 s后,立即蓋上瓶蓋,將其放于37 ℃厭氧發酵箱中發酵,每間隔4 h取樣一次,24 h后終止發酵并進行各項指標的測定。

表1 各試驗組與對照組設置Table 1 Set of each experimental and control group

1.2.3 發酵液中菌落數的測定 乳酸菌等益生菌合成并分泌的乳糖酶是體內乳糖酶的來源之一,其中雙歧桿菌的乳糖酶活性顯著高于其他腸道菌群[9]。因此本實驗在測定發酵液中乳酸菌數量的基礎上,又增加專門針對雙歧桿菌數量的測定。因MRS培養基作為乳酸菌基礎培養基被廣泛應用[21],陳曉蔚等[22]指出改良BBL培養基可選擇性培養雙歧桿菌并抑制乳酸桿菌生長[22]。因此,本試驗采用以上兩種培養基(BBL參考陳曉蔚等[22]配制)測定發酵液中的菌落數。參照陳影等[23]的方法,并適當調整如下:分別將上述兩種培養基固體粉末與水以一定比例混合,加熱煮沸并高溫滅菌后待用。將滅菌過的培養基(約10～20 mL)于超凈工作臺內倒入培養皿中,等待平板冷卻凝固。取少量發酵液(0.1 mL)于培養基表面并均勻涂布。于37 ℃恒溫培養48 h后,選取菌落數在30～300個之間的平板計數。

1.2.4 發酵液中pH測定 每隔4 h取一次樣,參考GB/T 1601-1993《農藥pH的測定方法》標準方法測定[24]。

1.2.5 發酵液中乳糖酶活性 按照乳糖酶試劑盒的要求進行操作并計算。

1.2.6 奶粉及發酵液中乳糖含量的測定 參考樊宏等[25]方法,并適當修改為:精確稱取1.000 g樣品于燒杯中(液體則根據蛋白質含量不同,精確稱取10.0～20.0 g樣品),用水溶解,移入200 mL容量瓶中并定容。從中精確吸取25.0 mL于100 mL容量瓶,緩慢加入5.0 mL乙酸鋅溶液(219 g/L)和5.0 mL亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L),加水定容并混勻。靜置30 min后,通過濾紙過濾,待測。同時做空白試驗。作乳糖標準曲線,測得乳糖含量線性回歸方程為C=4.5608×A+0.0487,結果表明吸光度與濃度呈良好的線性關系(R2為0.9728)。取2.0 mL樣品和試劑空白濾液于25 mL比色管,在波長520 nm處測定吸光值,按下式計算乳糖含量:

式中:X,乳糖的含量,g/100 g;C,根據回歸方程測得樣品中乳糖的含量,mg;M,樣品質量,g;V1,經稀釋樣品定容的體積,mL;V2,沉淀蛋白質時使用的稀釋樣品的體積,mL;V3,沉淀蛋白質時樣品定容的體積,mL;V4,測定時乳糖使用的體積,mL。

1.3 數據處理

數據均采用SPSS分析軟件(v23)中單因素ANOVA檢驗得出平均值、標準差以及顯著性分析等,并通過Excel軟件(2016)制圖。

2 結果與分析

2.1 KGM及OKGM紅外光譜分析

分別對樣品KGM和OKGM進行紅外光譜分析,從圖1可見,3406 cm-1處的多糖-OH特征吸收峰、873 cm-1處的表征β-D糖苷鍵構型的吸收峰、797 cm-1處的吡喃環呼吸振動峰都能明顯識別,說明經氧化改性所得的OKGM的主鏈結構與KGM一致,但1711 cm-1處出現了新的吸收峰,表明氧化形成了羧基(-COOH),結果與李斌等[19]研究結果一致。

圖1 KGM和OKGM紅外光譜圖Fig.1 KGM and OKGM infrared spectra

2.2 發酵液中菌落數的測定

由表2可知,在回腸發酵液中,KGM中、高劑量組和OKGM低、高劑量組的乳酸菌數量均顯著高于陰性對照組(P<0.05)。同時雙歧桿菌數量測定結果顯示,KGM各試驗組以及OKGM低、高劑量組的菌落數量均顯著高于陰性對照組(P<0.05)。在盲腸發酵液中,KGM、OKGM各試驗組和陽性對照組的乳酸菌數量均顯著高于陰性對照組(P<0.05),同樣的結果也可以在雙歧桿菌數量測定中觀察到。此外在回腸和盲腸發酵液中,對比KGM與OKGM兩組結果發現,相同劑量的KGM和OKGM各組間數據幾乎均無顯著性差異(P>0.05)。以上結果表明,KGM和OKGM對乳酸菌生長增殖均具有良好的促進作用,與秦清娟等[16]的研究結論一致:KGM對乳酸菌等腸道有益菌有明顯的促進增殖作用。

表2 發酵液中微生物數量Table 2 Microbial quantities in anaerobic fermentation

2.3 發酵液pH的變化

由圖2～圖5可知,經24 h體外厭氧發酵,回腸發酵液組與盲腸發酵液組pH測定結果呈現較為相似的現象:整體上,各組pH在24 h內呈下降趨勢,其中陽性對照組在兩類發酵液組別中均下降最多(回腸發酵液陽性對照組從7.5降至4.3,盲腸發酵液陽性對照組從7.5降至4.2);0～12 h,各組pH下降速度較快,且在12 h時同一類發酵液組間呈現較為明顯的差異:KGM高劑量組、陽性對照組12 h的pH均顯著低于其陰性對照組(P<0.05);12～24 h,各組pH均下降至最低點(回腸發酵液組平均降至4.4左右,盲腸發酵液組平均降至4.3左右)。比較可知,回腸發酵液和盲腸發酵液的KGM高劑量組pH在12 h均顯著低于其陰性對照組(P<0.05),但兩類發酵液的OKGM各劑量組在24 h時均與其陰性對照組無顯著性差異(P>0.05)?？赡艿脑驗?發酵液pH與其中微生物活性密切相關[26],據研究指出KGM可以促進乳酸菌等腸道益生菌的增殖[16],從而可能對發酵液pH造成明顯的影響,但KGM的氧化改性產物OKGM對發酵液pH的影響還未見相關研究報道,也值得后續深入研究。

圖2 KGM各劑量組及對照組回腸發酵液不同時段pH的比較Fig.2 Comparison of pH in each KGM group and control groupin ileum fermentation broths at different time

圖3 OKGM各劑量組及對照組回腸發酵液不同時段pH的比較Fig.3 Comparison of pH in each OKGM group and controlgroup in ileum fermentation broths at different time

圖4 KGM各劑量組及對照組盲腸發酵液不同時段pH的比較Fig.4 Comparison of pH in each KGM group and controlgroup in cecum fermentation broths at different time

圖5 OKGM各劑量組及對照組盲腸發酵液不同時段pH的比較Fig.5 Comparison of pH in each OKGM group and controlgroup in cecum fermentation broths at different time

2.4 發酵液中乳糖酶活性的測定

由表3可知,在8、12 h各組回腸發酵液中,KGM高劑量組、OKGM各劑量組和陽性對照組的乳糖酶活性均顯著高于陰性對照組(P<0.05)。在盲腸發酵液中,OKGM高劑量組和陽性對照組8 h的乳糖酶活性顯著高于陰性對照組(P<0.05),12 h只有OKGM中、高劑量組的乳糖酶活性顯著高于陰性對照組(P<0.05)。以上現象說明KGM和OKGM對發酵過程中乳糖酶活性具有促進作用,原因可能為乳糖酶活性隨著腸道內厭氧菌數量(腸道厭氧菌群主要為類桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌)的增加而增強[27],且KGM可促進雙歧桿菌、乳桿菌等腸道有益菌的生長[16],進而可能提高了乳糖酶活性。此外,相同劑量下OKGM組的乳糖酶活性整體較KGM組高。此現象可能因為KGM經氧化后分子鏈產生解聚[28],生成低分子甘露聚糖,更容易被微生物利用,此現象與Li等[29]研究結果相似:腸道微生物可以降解利用瓊膠和卡拉膠寡糖,但對高分子量瓊膠和卡拉膠的降解能力很低。

表3 8、12 h發酵液中各組乳糖酶活性Table 3 Lactase activity in 8 and 12

2.5 發酵液中乳糖含量的變化

由圖6、圖7可知,回腸發酵液各組在24 h內,乳糖含量整體呈現下降趨勢。4 h各組間乳糖含量開始呈現顯著性差異:KGM低劑量組、OKGM各劑量組和陽性對照組的乳糖含量顯著低于陰性對照組(P<0.05),提示KGM和OKGM可能有效加快乳糖代謝進程。4～24 h,各組乳糖含量繼續下降并在24 h降至最低值,其中,KGM中、高劑量組和OKGM各劑量組24 h乳糖含量均顯著低于陰性對照組(P<0.05)。

圖6 KGM各劑量組及對照組回腸發酵液不同時段乳糖含量的比較Fig.6 Comparison of lactose content in each KGM groupand control group in ileum fermentation broths at different time

圖7 OKGM各劑量組及對照組回腸發酵液不同時段乳糖含量的比較Fig.7 Comparison of lactose content in each OKGM groupand control group in ileum fermentation broths at different time

由圖8、圖9可知,體外厭氧發酵24 h,各組盲腸發酵液的乳糖含量也呈下降趨勢。4 h各試驗組和陽性對照組的乳糖含量均顯著低于陰性對照組(P<0.05),且KGM中劑量組和OKGM中、高劑量組的乳糖含量均顯著低于陽性對照組的乳糖含量(P<0.05),提示KGM和OKGM可能有效加快乳糖代謝過程。4～24 h內,各組乳糖含量較為平穩地降至最終值,且KGM低、中劑量組和OKGM中、高劑量組以及陽性對照組的24 h乳糖含量均顯著低于陰性對照組(P<0.05)。

圖8 KGM各劑量組及對照組盲腸發酵液不同時段乳糖含量的比較Fig.8 Comparison of lactose content in each KGM groupand control group in cecum fermentation broths at different time

圖9 OKGM各劑量組及對照組盲腸發酵液不同時段乳糖含量的比較Fig.9 Comparison of lactose content in each OKGM groupand control group in cecum fermentation broths at different time

以上結果說明,KGM和OKGM可有效降低經發酵奶粉的乳糖含量,4h即有明顯效果,表明對乳糖代謝具有明顯的促進作用。原因可能為腸道內乳酸菌等腸道益生菌含有乳糖酶,是體內乳糖酶的來源之一[9]。而KGM被證明可以促進此類腸道益生菌的生長繁殖[16],且由于厭氧菌數量越高(研究表明腸道內厭氧菌群最多的為類桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌),腸道內乳糖酶活性越大[27],從而可能使得乳糖含量明顯降低。

3 結論

實驗結果顯示,KGM與OKGM對乳酸菌有明顯的增殖作用:在回腸發酵液中,KGM中、高劑量組和OKGM低、高劑量組的乳酸菌數量均顯著高于陰性對照組(P<0.05);在盲腸發酵液中,KGM、OKGM各試驗組的乳酸菌數量均顯著高于陰性對照組(P<0.05)。同時,KGM與OKGM可顯著提高乳糖酶活性:8、12 h回腸發酵液中,KGM高劑量組、OKGM各劑量組的乳糖酶活性均顯著高于陰性對照組(P<0.05);盲腸發酵液中,OKGM高劑量組8和12 h的乳糖酶活性顯著高于陰性對照組(P<0.05)。此外,KGM和OKGM對乳糖代謝具有顯著促進作用:發酵4 h KGM低劑量組、OKGM各劑量組的回腸發酵液中乳糖含量顯著低于陰性對照組(P<0.05),同時各試驗組的盲腸發酵液中乳糖含量均顯著低于陰性對照組(P<0.05),且其中KGM中劑量組和OKGM中、高劑量組結果也顯著低于陽性對照組(P<0.05),提示KGM和OKGM可有效加快乳糖代謝;發酵24 h后KGM中、高劑量組和OKGM各劑量組的回腸發酵液中乳糖含量均顯著低于陰性對照組(P<0.05),且KGM低、中劑量組和OKGM中、高劑量組的24 h盲腸發酵液中乳糖含量均顯著低于陰性對照組(P<0.05)。綜上所述,添加了KGM或OKGM的奶粉可促進人體腸道內乳酸菌的生長,同時可促進乳糖的代謝,即明顯提高乳糖酶活性,加快乳糖的分解,并有效降低乳糖含量。