鐵含量測定的研究型教學實驗設計與實踐

王益林， 文輝忠， 舒 馨， 鐘青梅， 邱子情， 黃曉霞

（廣西大學化學化工學院，南寧530004）

0 引 言

研究型教學實驗將科學研究的思維方法和技能融入實驗教學中，具有綜合性、研究性和應用性的特點，可培養學生的創新意識，提高學生運用理論知識和實驗技能解決具體問題的綜合能力［1-3］。目前，國內許多高校正陸續開設并完善研究型教學實驗［4-6］。在基礎分析化學實驗中開設研究型教學實驗，既能提高學生學習分析化學的興趣、鍛煉實踐能力，也能培養學生的探索精神。為配合吸光光度法的教學，“鄰二氮菲吸光光度法測定鐵”是必做實驗，學生對這一實驗也很感興趣。作為一種重要的微量元素，鐵對人體健康有著較大的影響，缺鐵會影響血紅蛋白的合成，導致貧血癥。枸杞［7］、當歸［8］等中草藥及黑木耳［9］、香菇［10］等食物中鐵的含量較高，具有補鐵功能。3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）是一種安全而靈敏的還原型顯色劑，本身無色，在辣根過氧化物酶（HRP）或金屬離子（Cu2＋、Fe3＋）［11-13］的催化作用下，可被H2O2氧化生成最大吸收波長為652 nm 的藍色電荷轉移復合物。近年來，以TMB為顯色劑測定過氧化苯甲酰［14］、Ag＋［15］和ClO-［16］的研究也有報道。在文獻調研的基礎上，設計了利用Fe3＋氧化TMB 發生顯色反應測定實際樣品中鐵含量的研究型教學實驗，內容包括實驗條件的選擇、方法分析性能的評估、分析樣品的制備等完整的分析過程。該實驗有助于學生鞏固基礎分析化學知識，了解科研工作的基本過程，培養學生的科研素養。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

Ag＋能將無色的TMB 氧化成藍色的電荷轉移復合物，Fe3＋/Fe2＋和Ag＋/ Ag 兩電對的標準電極電位接近，Fe3＋顯氧化性，也能使TMB氧化顯色，當Fe3＋的濃度在一定范圍內時，溶液的吸光度與Fe3＋的濃度關系服從比爾定律，可實現對Fe3＋的含量進行測定。

1.2 主要試劑與儀器

NH4Fe（SO4）2·12H2O（廣東光華科技股份有限公司）；3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB，上海阿拉丁試劑有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，國藥集團化學試劑有限公司）；冰醋酸（廣東光華科技股份有限公司）；無水乙酸鈉（廣東光華科技股份有限公司）。以DMF為溶劑配制1.0 mmol/L TMB 溶液；Fe3＋標準溶液及其他溶液都以去離子水為溶劑配制。

UV-4802 紫外可見分光光度計（上海龍尼柯儀器有限公司）；H1850 離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限司）；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.3 實驗方法

在系列10 mL 的比色管中，依次加入4. 0 mL HAc-NaAc（pH ＝3.50）緩沖溶液、1.0 mL 1.0 mmol/L TMB溶液、1.0 mL不同濃度的Fe3＋標準溶液，用去離子水定容到刻度，充分混勻后在室溫下反應25 min，用1 cm的比色皿在UV-4802 紫外可見分光光度計掃描其吸收光譜，并記錄652 nm處的吸光度。

2 結果與討論

2.1 機理探討

采用飽和法對Fe3＋與TMB 反應的計量關系進行了研究，初步探討了TMB 的顯色機理。實驗時，固定Fe3＋的濃度，改變TMB 的濃度，得到系列［TMB］/［Fe3＋］比值不同的溶液，分別測其吸光度，并以吸光度為縱坐標、［TMB］/［Fe3＋］為橫坐標作圖，如圖1 所示。由圖1 可見，當［TMB］/［Fe3＋］的比值為2 時，在一定范圍內繼續增大TMB的濃度，體系的吸光度保持不變，由此認為TMB與Fe3＋反應的計量比為2∶1。結合相關文獻［16］，推測TMB 與Fe3＋可能的反應機理是在Fe3＋的作用下，TMB被氧化成藍色的電荷轉移復合物（見圖2）。

圖1 吸光度A隨［TMB］/［Fe3 ＋］的變化關系

圖2 TMB與Fe3 ＋可能的反應機理

2.2 測定條件的選擇

TMB的顯色反應一般在弱酸性條件下進行。實驗在pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 和5.5 的HAc-NaAc緩沖溶液中，測定50 μmol/L Fe3＋和100 μmol/L TMB反應25 min后的吸光度，以此確定發生顯色反應的最佳pH。圖3 數據表明，當pH ＝3.5 時，體系的吸光度值最大，因此，選擇pH ＝3.5 的HAc-NaAc緩沖液為反應介質。

圖3 pH對體系吸光度值的影響（［Fe3 ＋］＝50 μmol/L；［TMB］＝100 μmol/L；25 min）

按實驗方法，在pH ＝3.5 的HAc-NaAc 緩沖介質中，測定50 μmol/L Fe3＋和100 μmol/L TMB的混合液在不同反應時間的吸光度并確定最佳顯色時間。圖4所示數據表明，開始階段，溶液吸光度隨時間的增加而增大，顯色15 min 后繼續延長時間，吸光度保持穩定不變，實驗選擇在常溫下放置25 min后測吸光度。

圖4 反應時間對體系吸光度值的影響（［Fe3 ＋］＝50 μmol/L；［TMB］＝100 μmol/L；pH ＝3.5）

2.3 方法的分析性能

當Fe3＋離子濃度為50 μmol/L時，分別考察了濃度均為500 μmol/L的其他常見金屬離子對檢測信號的響應情況（見圖5）。實驗表明，K＋、Ca2＋、Mg2＋、Zn2＋、Cu2＋等常見金屬離子因不能使TMB氧化顯色而沒有信號響應，對Fe3＋的測定沒有干擾；但研究表明，等濃度的Ag＋和Cr6＋均產生干擾，不過一般植物樣品中這2 種元素的含量極少，說明方法的選擇性較好。

圖5 本方法測定Fe3 ＋離子的選擇性

按實驗方法，測定TMB 在系列不同濃度Fe3＋溶液中的吸收光譜。結果表明，溶液吸光度隨Fe3＋濃度的升高而增大（見圖6），且Fe3＋濃度在5 ～50 μmol/L范圍內服從比爾定律（見圖7），回歸方程為A ＝0.015 1C ＋0.012 9，相關系數（R2）為0.998 8，方法檢出限（3σ／k）為2.0 μmol/L。此外，從回歸方程可以得到，當λ ＝652 nm時，摩爾吸收系數ε ＝1.51 ×104L/（mol·cm），方法的靈敏度略高于用鄰二氮菲做顯色劑的測鐵法（ε ＝1.1 ×104L/（mol·cm）），可用于溶液中微量鐵的測定。

圖6 TMB在不同濃度Fe3 ＋溶液中的吸收光譜

圖7 吸光度與Fe3 ＋濃度的線性關系

2.4 實際樣品的測定

取適量枸杞在60 ℃鼓風烘箱內烘40 min，粉碎后稱取8.00 g置于坩堝內，在電爐上燒至完全變黑，轉移至馬弗爐內在800 ℃下焙燒2 h。冷卻至室溫后，加入5 mL濃硝酸、1 mL濃硫酸，在電爐上緩慢加熱至沸騰，溶液變棕色，繼續加熱至冒白煙并持續2 min，溶液呈淡黃色。冷卻后7 000 r/min離心5 min，取上清液，用濃NaOH調pH至4 ～6，用去離子水定容于100 mL容量瓶內，作為待測液。取1.0 mL 樣品待測液，按實驗方法測定，同時做2 種濃度的加標回收實驗，具體數據見表1。回收率分別為104%和108%，表明方法的準確度高，滿足微量分析要求。

表1 實際樣品中Fe3+含量的測定結果（n=3）

通過下式計算出樣品中鐵的含量：

式中：ρ為樣品中鐵的含量（μg/g），V為待測樣品經消解后定容到的體積（mL），C 為實際測得的鐵含量（mol/L），m為稱取的樣品質量（g）。經計算，所測樣品中鐵的含量為66.5 μg/g。

3 結 語

本實驗的設計依據學生所學分析化學理論知識并結合分析化學實驗基本操作技能，確保了實驗內容的綜合性；測定對象為大家熟悉的實際樣品，激發了學生學習的積極性。在反應機理的探討、實驗條件的選擇、方法分析性能的評估及分析樣品的制備與測定等一個完整的分析過程中，學生需運用所學理論知識去解析實驗數據，這樣可加深學生對分析化學基礎知識的理解，提高學生運用分析化學知識解決實際問題的能力。此外，通過實驗方案的設計及數據的分析和整理，學生既能從中體會到主動獲取新知的樂趣，也可提高其科研能力。此實驗在我校部分專業已開設3 年，教學效果良好。已有3 批學生依托紫外可見分光光度計申請了大學生創新實驗項目，申請來做畢業論文的學生也明顯增多，且其中1 人獲得省級優秀畢業論文，多人獲校級優秀論文。3 年來，以本科生為第一作者發表SCI和EI收錄的論文各1 篇，核心期刊論文1 篇。