Unc13基因胰島β細胞條件性敲除小鼠模型的構建和鑒定

李 奇 盧 晶 朱曉蓉 熊楓然 楊金奎

(首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科 糖尿病防治研究北京市重點實驗室 北京市糖尿病研究所，北京 100730)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM) 由于其經常累及身體多個系統和器官以及嚴重的合并癥，截至2017年，我國成年人糖尿病患病人數已達1.14億，占世界糖尿病患者總數的25%[1]。T2DM的主要致病原因為胰島β細胞的損害導致的胰島素分泌功能障礙，或者因為胰島素抵抗致使胰島細胞超負荷運轉造成功能的損傷。就胰島素分泌功能而言，T2DM患者的主要表現為胰島素雙相分泌模式的紊亂，即第一時相分泌延遲和第二時相分泌降低[2]。因此，深入了解胰島素雙相分泌的產生和調節機制對于理解糖尿病的發生、發展過程是非常重要的。研究[3]顯示，胰島素分泌的第一時相為“預備釋放池”中胰島素分泌顆粒的釋放，第二時相則涉及“儲存池”中胰島素分泌顆粒的動員和啟動[3]。然而，由于胰島素雙相分泌過程可能涉及多種因素的協同作用，胰島素顆粒分泌的調節過程仍有待進一步研究加以明確。

對于哺乳動物中Munc13蛋白來說，他們的秀麗隱桿線蟲直系同源物Unc13s和果蠅直系同源物Dunc13s已經有十多年的研究歷史[4]。Unc13基因首次在秀麗隱桿線蟲突變表型中發現，這些突變體攜帶一種未協調(uncoordinated/unc)的，與神經遞質的突觸前胞吐作用受損有關的表型，故被命名為Unc13基因[5]。Munc13蛋白家族在哺乳動物中由3個亞型(Munc13-1、Munc13-2、Munc-3)構成，主要為腦特異性佛波酯受體[6]，含有結合佛波酯的C1結構域和兩個C2結構域[7]，可以調節囊泡運輸，參與囊泡的引導、錨定及釋放過程。研究[8]顯示，Munc13-1與胰島素分泌顆粒的啟動密切相關，其缺失會損害第二時相胰島素分泌[8]。但是Unc13基因具體如何調節胰島素顆粒分泌仍不清楚。因此，本研究構建了特異性的基因修飾動物模型為研究提供幫助。

基因修飾動物模型是在活體動物上開展基因功能研究，是尋找合適藥物作用靶標的重要工具[9]。條件性基因敲除技術作為新一代基因敲除技術，與第一代基因敲除技術相比，有更高的特異性，因此具更為廣泛的應用前景。其中基于Cre-LoxP系統的條件性基因敲除小鼠因良好的實驗效果得到了青睞[10]。Cre重組酶是大腸桿菌噬菌體P1中Cre基因編碼表達的由343個氨基酸組成的相對分子質量為38 000的蛋白質，它可以特異性識別DNA上的LoxP序列，并根據LoxP序列的位置和LoxP序列之間的關系介導不同的特異性重組反映。

本研究采用Cre-LoxP系統構建了Unc13基因胰島β細胞條件敲除小鼠，為2型糖尿病發病機制研究提供了動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

胰島β細胞表達Cre重組酶的小鼠(以下簡稱CreT小鼠)由香港大學徐愛民教授饋贈，實驗動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。Unc13flox/flox轉基因小鼠(即僅插入了LoxP序列，未與Cre重組酶進行結合的小鼠，以下簡稱純合Flox小鼠)采用CRISPR/Cas9技術構建。遺傳背景均系C57/B6小鼠，按照SPF級動物飼養標準在北京大學醫學部 SPF級實驗動物中心進行飼養。實驗室溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。12 h光照，12 h黑暗，所有小鼠自由采食，飲水，小鼠飼料、飲水、墊料均經高溫高壓滅菌處理。實驗所使用的所有動物均經過首都醫科大學附屬北京同仁醫院動物委員會批準。

1.2 采用CRISPR/Cas9技術構建Flox小鼠

1.2.1 構建打靶載體

從NCBI小鼠基因組網站得到Unc13基因(Gene ID:208898)的序列和結構信息。在基因的非編碼區中選擇距離和長度適宜的2個區域插入同向的LoxP序列，并在LoxP序列兩端攜帶相應的同源序列，構建出兩段“同源序列-LoxP-同源序列”的DNA片段作為打靶載體。

1.2.2 顯微操作與F0代鑒定

將純化后的打靶載體通過顯微注射的方法注入小鼠胚胎干細胞中，得到攜帶LoxP突變基因的靶細胞。將中靶細胞注入小鼠囊胚中內，將囊胚植入假孕小鼠子宮，發育得到F0代LoxP突變基因的嵌合體小鼠。取小鼠尾部細胞進行培養，PCR擴增后通過DNA印跡確認LoxP突變基因已經整合到小鼠染色體上。為進一步驗證，將PCR產物進行TA克隆測序。

1.2.3 繁育純合突變小鼠

將嵌合體小鼠與野生型C57/B6小鼠進行繁育，得到F1代小鼠。通過基因型鑒定篩選出F1代雜合子，并用其作為親本。交配繁育F2代，得到的F2代再進行基因鑒定，最終得到兩條染色體均帶有LoxP突變基因的純合突變小鼠(以下簡稱為純合Flox小鼠)，從而建立突變群體。

1.3 Unc13基因胰島β細胞條件敲除小鼠構建

由于純合Flox小鼠的目的基因片段上下游均插入了同向的LoxP片段，將其與CreT小鼠進行雜交后，即能在特異性表達Cre重組酶的組織(本研究中為胰島β細胞)中將2段LoxP序列之間的基因刪除，同時生成一個終止子，以達到條件性敲除目的基因的作用，最終得到Unc13基因胰島β細胞條件性敲除小鼠模型。

1.4 小鼠基因型的鑒定

1.4.1 小鼠尾部基因組DNA提取

剪取21日齡小鼠尾尖0.5 cm置于1.5 mL的EP管內，加入400 μL裂解液和1 μL蛋白酶K儲存液，將上述EP管置于55 ℃恒溫水浴鍋水浴過夜，待消化完全，使用酚/氯仿法抽提基因組DNA。

1.4.2 小鼠基因組DNA的PCR擴增反應

下列反應物構成20 μL的反應體系：模板DNA 2.0 μL，緩沖液 (含Mg2+) 2.0 μL，dNTP混合物(10 mmol/L) 0.5 μL，引物混合液 (10 mol/L) 0. 5 μL， DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，超純水 14.5 μL。PCR反應條件：預變性95 ℃5 min；變性95 ℃30 s；退火58 ℃30 s；延伸72 ℃ 30 s；共40個循環，最后再延伸70 ℃10 min，之后25 ℃保存，引物序列見表1。

表1 引物序列

Fl: Flox;Wt: wild type;T:Cregene positive.

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳及結果分析

PCR之后通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。制備2%(質量分數)瓊脂糖凝膠，取PCR反應終產物5 μL進行電泳，135 V 20 min。電泳后利用凝膠成像系統進行電泳圖片分析。根據電泳結果篩選含有目的條帶的小鼠，判斷對應小鼠是雜合子還是純合子。

圖1 Cas9設計策略Fig.1 Design strategy of Cas9UTR: untranslated regions

1.5 小鼠腹腔葡萄糖耐量實驗(intra-peritoneal glucose tolerance test，IPGTT)及血清胰島素濃度測定

小鼠禁食12～14 h后，腹腔注射20%(質量分數)葡萄糖溶液，注射體積為小鼠體質量(g)×10 μL，用固定器固定小鼠，分別測定葡萄糖負荷后0、15、30、60和120 min時小鼠尾靜脈血糖濃度。并于0、15、30 min 自眼眶靜脈叢采血，留取血清，采用小鼠超敏胰島素ELISA試劑盒(美國Milipore公司)測定血清胰島素濃度。血糖測定用美國強生公司One-Touch血糖儀及配套試紙。

1.6 統計學方法

采用Prism7(GraphPad Software)軟件進行統計分析。兩組間均數比較采用獨立樣本的Mann-WhitneyU檢驗。組間和時間均數比較，采用雙因素重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Flox小鼠構建策略

通過NCBI小鼠基因組網站得到Unc13基因(Gene ID:208898)的序列和結構信息，選擇Exon2和Exon3作為目的基因片段，在其上下游分別插入一段同向的LoxP序列，構建出攜帶有LoxP序列的Flox小鼠(圖1)。

2.2 F1代雜合Flox小鼠構建及基因型鑒定

將F0代Flox小鼠與野生型C57/B6小鼠進行繁育，得到F1代小鼠。從鼠尾中提取出DNA樣品，采用PCR擴增的方法檢測LoxP片段。理論上，不含LoxP片段的小鼠可見條368 bp條帶，LoxP純合子只有一條466 bp條帶，雜合子有368 bp和466 bp兩條帶(圖2A)。為進一步驗證，將PCR產物進行TA克隆測序(圖2B)。LoxP序列成功結合到小鼠Unc13基因相應部位，27、28、29、36、38、39號均為雜合子Flox小鼠。

圖2 Flox小鼠F1代基因型鑒定Fig.2 Flox mice genotype identificationA:27-39:mice; B: Flox mice sequencing results,LoxP sequence is highlight;TRANS 2K:marker; TRANS 2K PLUS II marker(bp): 8 000,5 000,3 000,2 000,1 000,750,500,250,100; 500 bp is highlight; P:positive control; B6: C57/B6;N: negative control.

2.3 胰島β細胞條件性敲除鼠構建及基因型鑒定

將純合Flox小鼠與CreT小鼠進行雜交，得到特異性表達Cre重組酶的Flox雜合鼠(基因型為Unc13flox/wtCreT)和沒有特異性表達Cre重組酶的Flox雜合鼠(基因型為Unc13flox/wtCreW)。將其作為親本進行雜交，可得到表達或不表達Cre重組酶的Flox純合鼠(基因型為Unc13flox/floxCreT或Unc13flox/floxCreW)，即為本研究構建的Unc13基因胰島β細胞條件性敲除鼠及其對照鼠。

從鼠尾中提取出DNA樣品，采用PCR擴增的方法分別檢測LoxP片段(圖3A)和Cre片段。表達Cre重組酶的鼠在481 bp處可見條帶，不表達者則在相應位置沒有條帶(圖3B)。成功構建出Unc13基因胰島β細胞條件性敲除鼠(編號為87、91、92、93，基因型為Unc13flox/floxCreT，即Unc13 KO鼠)及其對照鼠(編號為88、89、90，基因型為Unc13flox/floxCreW，即WT鼠)。

圖3 條件性敲除小鼠基因型鑒定結果Fig.3 Conditioned knockout mice genotype identificationA: 87-93:mice, identify LoxP gene, LoxP is 466 bp;B: 87-93:mice,identify Cre gene,CreT is 481 bp,CreW is none;DL 2 000: marker;DL 2 000 marker(bp):2 000,1 000,750,500,250,100.750 bp is highlight;P:positive control; B6: C57/B6;N: negative control.

2.4 Unc13 KO小鼠葡萄糖代謝能力下降

選取9周齡的基因型為CreTUnc13flox/flox(以下簡稱Unc13 KO鼠)和CreWUnc13flox/flox(以下簡稱WT鼠)兩種小鼠作為實驗組和對照組進行GTT和胰島素分泌實驗。雌雄Unc13 KO小鼠在30 min和60 min 的血糖濃度均明顯高于對照組(P<0.05)。Unc13 KO雄鼠的血糖值曲線下面積較對照組明顯升高(P<0.05)，雌鼠的血糖值曲線下面積雖較對照組也有升高，但差異無統計學意義(P>0.05),詳見圖4。

圖4 IPGTT實驗結果Fig.4 IPGTT resultsA： blood glucose levels of male mice,WT, n=6, KO: n=3; B：AUC of male mice;*P<0.05 vs WT; C: blood glucose levels of female mice; WT: n=5, KO: n=3. D: AUC of female mice; IPGTT: intra-peritoneal glucose tolerance test; KO:knockout; WT: wild type; AUC: area under curve.

2.5 Unc13 KO小鼠胰島素分泌功能受損

分別測量普通飼養的11周齡Unc13 KO小鼠與WT小鼠的胰島素分泌水平。Unc13 KO小鼠在15 min 和30 min的胰島素質量濃度明顯低于對照組(P<0.05),Unc13 KO雄鼠的胰島素質量濃度曲線下面積較對照組明顯升高(P<0.05)。雌鼠的胰島素分質量濃度曲線下面積雖較對照組也有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖5。

圖5 胰島素分泌實驗結果Fig.5 Insulin release resultsA:serum insulin levels of male mice; WT: n=6, KO: n=3; B:AUC of male mice;*P<0.05; C:serum insulin levels of female mice;WT: n=5; KO: n=3; D:AUC of female mice; KO: knockout; WT:wild type;AUC:area under curve.

3 討論

胰島素抵抗與胰島β細胞缺陷是2型糖尿病兩個重要的病理生理改變。目前認為，胰島素抵抗在2型糖尿病發生、發展過程中發揮重要的作用[11]，但單獨的胰島素抵抗不足以引發糖尿病，只有當胰島β細胞不能代償胰島素抵抗時，糖尿病才發生[12]；胰島β細胞缺陷在2型糖尿病發生、發展中發揮中心性作用[13]。

胰島β細胞的主要功能為胰島素的合成、儲存、運輸和釋放。就胰島素的釋放而言，其需要一系列的準備過程，包括分泌囊泡向細胞質膜的遷移，囊泡的錨定，胞吐過程的啟動等步驟[14]，此過程受蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)[15]、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)[16]、蛋白激酶A (protein kinase A，PKA)[17]、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)[17]和Ca2+[18]等因子調控，任何一個環節受損都可能導致胰島素分泌功能障礙。Munc13-1蛋白可作用于囊泡的錨定過程，通過輔助SNAREs蛋白促進囊泡膜與細胞膜半融合中間體的形成[19-23]。而Unc13基因在胰島素釋放過程中的作用仍不得而知，所以，構建動物模型進行研究就顯得極為重要。

基于Cre-LoxP系統的條件性基因敲除技術因其良好的實驗效果而成為熱門的基因編輯技術[24-25]。本實驗通過構建Unc13flox/flox轉基因小鼠，并將其與Ins2-Cre鼠雜交，通過繁育最終得到Unc13基因胰島β細胞條件敲除小鼠。通過進行小鼠葡萄糖耐量實驗及胰島素測定，筆者發現Unc13 KO鼠的確存在糖耐量降低，胰島素分泌水平下降的表現。后期實驗將通過增加樣本量，高糖、高脂等特色條件誘導Unc13 KO鼠，相信能對Unc13基因的作用有更深入的了解。

本研究成功構建了Unc13基因胰島β細胞條件敲除小鼠模型并進行了初步實驗，但還存在一些問題。比如對Unc13 KO鼠的胰島β細胞的功能研究還不夠深入，也并沒有闡明Unc13基因發揮作用的具體機制。后續應在提取原代胰島β細胞后，進行形態學檢查、葡萄糖刺激的胰島素分泌實驗、探究蛋白質之間相互作用等實驗來更進一步的研究Unc13基因的功能，從而為Unc13基因與胰島素分泌的相關性研究提供新的基礎研究數據和結果。