儲存條件對尿觸珠蛋白檢測的影響

鄭曉敏 楊芳遠 劉翠平 楊金奎

(1.清華大學附屬垂楊柳醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100022； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100730； 3.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京 100730； 4.北京市糖尿病研究所,北京 100730)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease, DKD)是重要的糖尿病微血管合并癥，是導致慢性腎功能受損的重要原因[1-2]，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。DKD起病隱匿，進入大量蛋白尿期后，其進展到終末期腎病的速度大約是其他原因腎臟病的14倍。因此，DKD的早期診斷是預防糖尿病患者腎功能迅速進展的基礎(chǔ)，在糖尿病患者中研究可以早期預測腎功能惡化的生物標志物具有重要的臨床意義。尿液分析因其獲取簡便、收集無創(chuàng)和可提供大量腎臟生理變化發(fā)展進程的信息，多年來一直是腎臟疾病研究的重點，近年來多項研究[3-4]顯示，尿觸珠蛋白(haptoglobin，Hp)可以作為糖尿病患者腎功能受損的早期標志物，在早期DKD中可預測腎功能的進展。由于尿液標本成分復雜，影響因素眾多，尿Hp作為一種蛋白質(zhì)具有易降解及結(jié)構(gòu)變化等特點，其檢測容易受多種因素的影響，尿標本的正確儲存是尿Hp檢測結(jié)果準確的基礎(chǔ)。檢測結(jié)果的不可靠可能給臨床帶來錯誤的信息，引起臨床的誤診和漏診。因此為避免長時間保存影響檢測結(jié)果，實驗室常規(guī)流程中要求標本采集后2 h內(nèi)送檢并完成檢測[5]。但臨床中常常會出現(xiàn)檢測延遲的狀況，延遲檢測時該如何保存尿液標本才能盡量減少尿Hp濃度的變化，目前尚未見相關(guān)報道。本文將探討采用不同的標本處理方法及不同保存溫度和時間的尿標本Hp濃度的變化。

1 對象與方法

1.1 標本收集

選取2019年7月在首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科住院診治的2型糖尿病患者40例，其中男性21例，女性19例，年齡34～87歲，平均年齡(60.50±12.98)歲，所有入選患者符合1999年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)糖尿病專家委員會提出的糖尿病診斷標準[6]：“糖尿病癥狀(如多飲、多尿、多食、體質(zhì)量減輕)加上任意時間血糖≥11.1 mmol/L，或空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)≥7.0 mol/L，或口服葡萄糖耐量實驗(oral glucose tolerance test,OGTT)≥11.1 mmol/L”，若無臨床表現(xiàn)，需再測一次予以證實后確診。于早上8∶00留取晨起第二次尿標本10 mL于15 mL離心管中，收集方法為自然排尿法，留取中段尿，應避免經(jīng)血、白帶、精液、糞便等混入。

1.2 標本處理

標本收集后立即送至實驗室，基礎(chǔ)值于收集后半小時內(nèi)檢測。樣本顛倒混勻5次后取2 mL分別置于兩個1.5 mL EP管中，其中一個EP管不經(jīng)離心，直接分為兩份，置于兩個EP管中，分別置于室溫(25 ℃)和冰箱冷藏(4 ℃)。另一個EP管600g離心5 min，取出上清液分別置于兩個EP管中，再分別置于室溫(25 ℃)和冰箱(4 ℃)冷藏。分別于放置3、6和24 h后檢測尿Hp濃度。每次檢測前確保樣本顛倒混勻5次。

1.3 Hp檢測

采用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)(夾心法) 使用尿微量觸珠蛋白ELISA 檢測試劑盒(由石家莊和亞生物有限公司提供，4 ℃保存)檢測尿Hp濃度。檢測前樣本600g離心5 min。向預先包被了人Hp單克隆抗體的酶標孔中加入標準品及樣品10 μL/孔，震蕩混勻，37 ℃孵育60 min，洗去多余抗體后，加入與辣根過氧化物酶結(jié)合的人Hp單克隆抗體(HRP-Hp)100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗去多余二抗后，加入酶特異性底物顯色劑100 μL/孔，震蕩混勻，置37 ℃避光顯色15 min，加入終止劑50 μL/孔，使用Thermo scientific Multiskan FC型酶標儀以波長450 nm比色測定，標準曲線采用雙對數(shù)擬合，通過標準曲線計算標本Hp濃度。每板使用Hp質(zhì)控品(40 ng/mL)進行質(zhì)控。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗不符合正態(tài)分布，因此資料使用中位數(shù)(P25，P75)表示，組間中位數(shù)比較采用配對樣本的秩和檢驗(Wilcoxon符號秩檢驗)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 儲存時間對Hp檢測結(jié)果的影響

標本不離心處理，室溫(25 ℃)放置3 h和6 h尿Hp濃度較基礎(chǔ)值無明顯變化(P>0.05)，室溫放置24 h，尿Hp濃度較基礎(chǔ)值明顯下降(P<0.01)。冷藏(4 ℃)儲存放置3 h較基礎(chǔ)值無明顯變化(P>0.05)，而放置6 h時尿Hp濃度明顯下降(P<0.01)。標本經(jīng)600g離心5 min處理后室溫放置3 h尿Hp濃度較基礎(chǔ)值無明顯變化(P>0.05)，室溫放置6 h和24 h后，尿Hp濃度較基礎(chǔ)值明顯下降(P<0.01)。冷藏(4 ℃)儲存放置3 h較基礎(chǔ)無明顯變化(P>0.05)，而放置6 h時尿Hp濃度明顯下降(P<0.01),詳見表1。

2.2 離心對尿Hp檢測結(jié)果的影響

經(jīng)600g離心5 min的標本于室溫儲存3 h和6 h后，其尿Hp檢測結(jié)果明顯低于未離心標本(P<0.01)。而于冷藏儲存時，標本放置3 h和6 h，離心標本與未離心標本結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表2。

2.3 儲存溫度對尿Hp檢測結(jié)果的影響

未離心尿標本放置3 h時，常溫與4 ℃相比,尿Hp檢測結(jié)果無顯著變化(P>0.05)，放置6 h時，4 ℃標本的尿Hp檢測結(jié)果顯著低于常溫標本(P<0.01)。經(jīng)600g離心5 min的標本與未離心標本結(jié)果相似，放置3 h時，常溫與4 ℃相比尿Hp檢測結(jié)果無顯著變化(P>0.05)，放置6 h時，4 ℃標本的尿Hp檢測結(jié)果顯著低于常溫標本(P<0.05),詳見表3。

表1 放置時間對尿標本Hp濃度的影響

avs0 hour;bCentrifuge for 5 min at 600g;Hp:haptoglobin.

表2 離心對尿Hp檢測結(jié)果的影響

*Centrifuge for 5 min at 600g;Hp:haptoglobin.

表3 儲存溫度對尿Hp檢測結(jié)果的影響

*Centrifuge for 5 min at 600g;Hp:haptoglobin.

2.4 不同尿Hp濃度標本放置不同時間和溫度對尿Hp分組的影響

根據(jù)尿Hp濃度將樣本分為3組：正常Hp組(Hp<20 ng/mL)、微量Hp組(Hp≥30 ng/mL～<200 ng/mL)和大量Hp組(Hp≥200 ng/mL)。表4統(tǒng)計了尿Hp濃度變化后引起當前分組變化的標本數(shù)量。正常Hp組標本儲存24 h時比較穩(wěn)定，僅在6 h 常溫放置的不離心標本和6 h 4 ℃放置的離心標本中各有1例其檢測結(jié)果高于20 ng/mL，其余標本的濃度變化均未改變當前分組。微量Hp組放置3 h時各種方法的標本變化均不大，僅1～3個標本的變化引起分組變化，但放置6 h時，常溫放置的不離心和離心標本分別有1個和3個標本變化，而冷藏保存的標本引起分組變化的標本數(shù)量為7個和8個。大量Hp組的結(jié)果與微量Hp組結(jié)果相似，放置3 h時各種儲存條件均僅有0～2個標本變化引起分組變化，放置6 h時變化最少的是不離心常溫放置,詳見表4。

表4 尿Hp濃度變化后引起分組變化的標本數(shù)量

3 討論

DKD是糖尿病的常見微血管合并癥，是我國慢性腎臟病的重要病因，也是導致終末期腎臟病的主要病因，給糖尿病患者帶來高致殘率及致死率。約20%～40%的DM患者最終發(fā)展為DKD[7]。DKD若能早期診斷，強化降糖和降壓治療及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)抑制劑的治療可以延緩腎臟功能惡化的進展速度。研究[8]證明，目前常規(guī)使用的尿微量白蛋白對診斷2型糖尿病腎病的特異性不足，對預測病情的轉(zhuǎn)歸也存在局限性。近年來多項研究[3-4]顯示,尿Hp可以作為糖尿病患者腎功能受損早期診斷的生物標志物，它在早期DKD中可以預測腎功能的進展。

Hp是一種炎性反應的急性期反應蛋白，是人體內(nèi)血清α2球蛋白成分的一種，其廣泛分布于血液和其他體液中，其合成的主要部位為肝臟[9]。Hp主要的生理功能是與血液中的游離血紅蛋白(hemoglobin，Hb)結(jié)合并被清除，阻止游離Hb進一步發(fā)生氧化還原反應導致相應的組織損傷[10]。糖尿病患者血中Hp的濃度較無糖尿病患者增高， DKD早期腎小球濾過屏障發(fā)生病理異常，導致腎小球濾過屏障不穩(wěn)定，可允許Hp及Hb-Hp復合物通過濾過屏障[11-12]?？沙霈F(xiàn)尿中Hp增高。另外，近年來有研究[13]顯示，腎臟近曲小管的上皮細胞在某些病理情況下可以合成和分泌Hp，導致尿中Hp增高。

雖然目前已有多項研究[3-4]證實尿Hp濃度對DKD的早期診斷的臨床意義，但由于尿液標本成分復雜，影響因素眾多，因此為避免長時間保存影響檢測結(jié)果，常規(guī)關(guān)于尿液檢驗要求盡可能留尿后2 h內(nèi)完成檢測。但由于臨床條件所限，常常會有檢測延遲的情況，當不能滿足2 h內(nèi)檢測的要求時，轉(zhuǎn)運過程中是否需要冷藏保存，標本中Hp可以保持穩(wěn)定多長時間，是尿Hp作為DKD標志物廣泛應用于臨床前亟待解決的問題。本研究結(jié)果顯示,標本不離心處理，室溫放置3 h和6 h尿Hp濃度無明顯變化，室溫放置24 h，尿Hp濃度明顯下降，冷藏放置3 h，尿Hp濃度無明顯變化，而放置6 h時尿Hp濃度明顯下降。離心處理后的標本室溫和冷藏放置3 h尿Hp濃度無明顯變化，室溫和冷藏放置6 h及室溫放置24 h，尿Hp濃度均明顯下降。因此若尿標本可在3 h內(nèi)檢測，不論何種處理方式或者儲存方式均可保證尿hp濃度的穩(wěn)定。室溫放置6 h的未離心標本可保持尿Hp濃度穩(wěn)定。冷藏及離心可導致尿Hp濃度的降低。

另外，尿Hp濃度變化帶來的臨床意義與尿Hp基礎(chǔ)濃度相關(guān)。因為尿Hp的臨床意義主要是其濃度升高提示糖尿病患者的腎臟受損，因此對于低濃度的尿Hp患者其Hp濃度進一步降低并不會導致對臨床結(jié)果判定的改變，而高濃度的基礎(chǔ)尿Hp標本若出現(xiàn)其濃度下降，將導致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，或者將大量Hp的患者判定為微量Hp患者。本研究結(jié)果證實對于尿Hp濃度正常的患者，其尿液標本放置24 h內(nèi)檢測較少導致臨床意義的改變，而對于尿中含有微量和大量Hp的患者，尿Hp濃度的延遲檢測可能導致結(jié)果的誤判。在常溫放置6 h內(nèi)較少發(fā)生誤判，但冷藏放置6 h可導致約半數(shù)的誤判。多數(shù)標本主要表現(xiàn)為尿Hp濃度的降低，導致疾病的漏診。因此認為當延遲檢測不可避免時建議常溫放置不超過6 h，無需冷藏放置。

目前尚未見關(guān)于尿Hp保存條件的相關(guān)報道，但不同溫度條件下，各種尿液其他檢測指標的穩(wěn)定性有相關(guān)報道。尿中肌酐的穩(wěn)定性較好，在4 ℃或25 ℃將標本放置30 d，尿中肌酐濃度仍能保持穩(wěn)定[14]。而尿糖在冷藏(4 ℃)條件下僅能穩(wěn)定24 h[15]。室溫或是冷藏條件下尿液標本不適宜存放超過24 h。若需長時間保存尿液標本需進行低溫凍存。在-20 ℃冰凍狀態(tài)下，尿肌酐濃度在6個月內(nèi)可保持穩(wěn)定[16]。由于微量白蛋白尿?qū)δI臟疾病的診斷作用，目前關(guān)于尿微量白蛋白儲存條件的研究引起廣泛關(guān)注[17-18]。儲存后的尿標本的微量白蛋白檢測結(jié)果的影響因素包括儲存時間、儲存溫度、儲存容器、白蛋白濃度、標本pH值、檢測方法等。尿白蛋白濃度在室溫下可放置1～3 d 保持濃度穩(wěn)定，冷藏可放置保存3～7 d穩(wěn)定[19]。含有防腐劑的尿液標本白蛋白/肌酐比率在4 ℃ 和18 ℃穩(wěn)定7 d，在30 ℃穩(wěn)定2 d。含防腐劑的樣本在3個凍融循環(huán)后及-80 ℃冷凍存儲6個月均穩(wěn)定[20]。

本研究結(jié)果中提示,低溫和離心后長時間放置可導致尿Hp濃度的下降，其原因考慮可能為：1)人類尿液樣本中存在尿蛋白酶，可以降解儲存的尿液中的各種蛋白質(zhì)，并且在低pH條件下尿蛋白酶的活性會增加[21]，尿中酶類物質(zhì)分解Hp導致尿標本中Hp降解，因此尿Hp濃度下降；2)低溫后尿中磷酸鹽、尿酸鹽、草酸鹽等可溶性結(jié)晶析出，析出的結(jié)晶與Hp結(jié)合形成復合物后沉淀析出，導致可溶性尿Hp濃度減低；3)尿中Hp可能與其他物質(zhì)結(jié)合形成復合物沉淀，如高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、某些炎性反應介質(zhì)等[22]；4)尿pH值較血pH值低，可能導致尿Hp的析出；5)低溫可能導致蛋白結(jié)構(gòu)變化、部分沉淀、抗體結(jié)合位點丟失或者吸附到管壁；6)本研究中采用ELISA夾心法檢測，Hp與單克隆抗體反應后形成的免疫復合物，尿液中結(jié)晶等雜質(zhì)可能影響抗原抗體的結(jié)合，影響尿Hp濃度的檢測。

本研究由于標本量較小，實驗結(jié)果尚需進一步大樣本研究來證實。但本研究提示,針對可以提示DKD的指標——尿Hp濃度的檢測，若6 h內(nèi)可完成檢測推薦常溫儲存，不適當?shù)姆磸蜏囟鹊淖兓炊鴷绊懩騂p濃度的檢測。