妊娠期血糖異常者葡萄糖激酶基因突變篩查

元沙沙 馬 燕 吳南楠 許月超 楊龍艷 柯 靜 趙 冬

(首都醫科大學附屬北京潞河醫院內分泌代謝與免疫性疾病中心 糖尿病防治北京市重點實驗室，北京 101149)

葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)作為一種葡萄糖傳感器，在胰腺β細胞的葡萄糖代謝和胰島素分泌中起著重要的作用[1]。GCK突變與胰島素分泌和肝糖原合成的缺陷有關，導致胰腺對葡萄糖的感受性下降，出現輕度慢性高血糖、糖耐量受損或糖尿病，這種糖尿病稱為青少年發病的成年型糖尿病2型(maturity onset diabetes of the young 2, MODY2)，又稱葡萄糖激酶基因突變型青少年起病的成年型糖尿病(glucokinase-maturity onset diabetes of the young,GCK-MODY)，主要表現為輕度、持續性的、穩定性的高空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，并以常染色體顯性遺傳的方式遺傳[2]， MODY2患者一般無須口服藥物或使用胰島素，通過控制飲食及增加運動即可穩定血糖。但由于其表型隱匿，無明顯惡性臨床后果，除基因檢測之外，難以尋找其獨特的臨床特征，易被誤診為1型或者2型糖尿病，造成不必要的胰島素或者口服降糖藥治療， MODY2的診斷標準是對GCK基因測序，但對于中國龐大的糖尿病人群，對所有可疑患者進行基因測序是不現實的。探索一種更有效的MODY2篩查機制來識別GCK突變患者是十分必要的。本研究結合現有的MODY2的臨床特點，制定了空腹靜脈血糖聯合血清三酰甘油的新標準，在妊娠期血糖異常人群中進行MODY2糖尿病篩查。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2016年1月1日至2018年12月31日在首都醫科大學附屬北京潞河醫院進行常規產檢和分娩的婦女。受試者在孕早期(1～12周)、孕中期(13～27周)及孕后期(28周至分娩)3個時期均進行了空腹血糖、血清三酰甘油的檢查；孕期24～28周進行口服75 g葡萄糖耐量試驗，孕期未進行口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)者不予排除。排除標準：孕期空腹靜脈血糖及血清三酰甘油檢查資料不全；嚴重的系統性疾病如腫瘤患者；孕前已有明確糖尿病應用胰島素或口服降糖藥治療者；不同意參加本研究者。由經過培訓的首都醫科大學附屬北京潞河醫院醫務人員對受試者隨訪進行問卷調查、體格檢查，并告知葡萄糖激酶基因檢測的目的和方法，患者知情、理解并同意后，簽署《GCK基因檢測知情同意書》。本研究經首都醫科大學附屬北京潞河醫院醫學倫理委員會認定，該項研究的所有方法學，涉及醫學倫理學方面的問題符合赫爾辛基宣言的要求(倫理審查批件號：2014-KS-011)。

1.2 研究方法

1.2.1 葡萄糖激酶突變篩查條件

GCK基因突變患者的空腹靜脈血糖通常高于5.5 mmol/L[3]，而OGTT試驗2 h血糖增量通常在3.0～4.6 mmol/L[4]，而患者的血清三酰甘油常低于1.43 mmol/L[5]。因此，本研究中本課題組制定了符合GCK基因突變篩查條件：孕早期(1～12周)、孕中期(13～27周)及孕后期(28周至分娩)3個時期空腹血糖檢查，均≥5.5 mmol/L；且至少有1次血清三酰甘油≤1.43 mmol/L；孕期24～28周口服75 g葡萄糖耐量試驗者2 h血糖增量<4.6 mmol/L，孕期未進行OGTT試驗者不予排除。對于滿足上述3條標準的受試者進行GCK基因測序，并采集其一般資料如年齡、身高、孕前體質量、一級親屬糖尿病家族史，是否應用降糖方案等。

1.2.2GCK基因突變檢測

采用標準酚氯仿法從符合GCK檢測標準的受試者外周血中提取DNA樣本并于-80 ℃冰箱中存儲。利用PCR 擴增技術捕獲外顯子，經ABI3730 對所選樣本進行Sanger 測序，測序結果經DNAstar軟件子程序SeqMan軟件分析，根據美國醫學遺傳學與基因組學學會基因變異分級體系對疑似致病突變分級，同時對未見報道的突變或者是臨床意義不明確的突變進行軟件預測及群體數據庫注釋。GCK基因外顯子的PCR所用引物詳見表1。

表1 葡萄糖激酶基因擴增及測序引物

GCK: glucokinase;F：forward primer;R：reverse primer.

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 篩查結果

本研究共對2 454名受試者進行篩查，其中滿足孕期3次FBG均≥5.5 mmol/L，至少有1次三酰甘油≤1.43 mmol/L者，且滿足OGTT試驗2 h血糖增量<4.6 mmol/L的受試者12例，陽性率為0.49%。實際獲得符合GCK基因篩查條件患者的外周血DNA樣本5例，測得GCK基因突變者1例，未突變者4例。進行GCK測序者的臨床特征詳見表2。

表2 進行GCK測序者的臨床資料

患者B為GCK基因突變患者，首次就診年齡為29歲，具有糖尿病病史7年，一級親屬中有糖尿病家族史，孕前體質量指數(body mass index, BMI)為26.4 kg/m2。患者本次就診的空腹血糖為7.25 mmol/L，三酰甘油為0.81 mmol/L，均符合GCK基因突變患者的臨床診斷標準。

2.2 GCK基因測序結果

GCK基因突變患者的測序結果詳見圖1(雙峰處為堿基突變位點)。參比序列為NM_033507，NP_277042。突變區域：c.784G>A,p.G262R,rs104894008。

圖1 GCK突變患者測序峰圖Fig.1 Sequencing result of patients with GCK mutationGCK: glucokinase

3 討論

本研究通過監測孕期空腹血糖與三酰甘油，篩選出MODY2患者，并進行了基因檢測，發現1例GCK基因突變引起的MODY2，其突變符合經典的MODY2致病位點[6]。GCK突變引起的MODY2糖尿病在各個地區和人種中的發病率差異較大，中國人群中MODY2糖尿病的患病率初步估計為0.4%，中國妊娠期血糖異常人群中GCK最小突變率為0.27%[7-8]。而在所有的MODY糖尿病家系中，MODY2患病率高達10.4%[9]。此外，GCK突變也是造成兒童時期高血糖的主要原因。迄今為止，關于我國GCK突變的真實患病率，仍舊存在爭議。最新研究[5]表明MODY2在自然人群和糖尿病患者中的患病率分別為0.21%和1.3%。由于我國人口基數龐大，初步估計我國自然人群中的MODY2患病人數為273萬，因此不能忽略潛在的龐大MODY2人群。本研究中的MODY2患者曾被誤診為2型糖尿病合并妊娠，孕期應用胰島素控制血糖。錯誤的診斷增加了患者額外的治療花費、心理負擔以及藥物不良反應風險。目前診斷MODY2的方法并不簡單，大規模的基因測序由于不可避免的經濟成本而難以推廣。經典的MODY篩查臨床標準包括以下特點：非肥胖患者，缺乏自身抗體證據，家族中父母至少有一方起病年齡小于25歲，至少三代連續的糖尿病家族史[10]。國際上MODY2患者的核心臨床特征為自然人群：①空腹血糖≥5.5 mmol/L(98%)，且為持續性(至少3次獨立發生的)和穩定性的(持續幾個月或幾年)[11]。②糖化血紅蛋白稍高于正常水平但很少超過7.5%。③OGTT增加幅度(OGTT 2 h減空腹血糖)較小(71%的患者小于3 mmol/L)，98%的患者小于4.6 mmol/L)。④父母被診斷為“2型糖尿病”，至少一方的空腹血糖會輕微升高(5.5～8.0 mmol/L)，但無合并癥，或不是糖尿病患者。妊娠人群[12-13]：①懷孕前、懷孕中、懷孕后持續性升高的空腹血糖(5.5～8 mmol/L)。②至少1次OGTT血糖差值小于4.6 mmol/L(孕期或者懷孕后)。③父母可能會有輕微的2型糖尿病，但家族史缺失患者不應排除診斷。④孕前體質量指數小于25 kg/m2可提高診斷效率。近年來，研究[14-16]顯示較低濃度的三酰甘油也是MODY2的特點之一。

結合現有國內的MODY2的特征，制定出了符合中國人群特點的GCK突變篩查策略：以孕早期(1～12周)、孕中期(13～27周)、孕后期(28周至分娩)3個時期空腹血糖檢查，至少3次均≥5.5 mmol/L，且至少有1次三酰甘油≤1.43 mmol/L；孕期24～28周口服75 g葡萄糖耐量試驗者2 h增量<4.6 mmol/L，孕期未進行OGTT試驗者不予排除。并且中國的晚婚晚育及計劃生育關于第二胎政策的調整，決定了中國人群的生育年齡普遍增加，因此發病年齡<25歲也不作為本研究推薦的篩選標準。最終，本研究根據GCK篩選標準在研究人群中檢測出1名MODY2患者。該患者為年輕育齡期女性，首次分娩年齡23歲，身高157 cm，孕前BMI<25 kg/m2，首次孕期被診斷為妊娠期糖尿病，建議應用胰島素治療，但血糖控制不佳，未進一步明確基因分型檢查。由患者資料分析，可見該患者符合MODY2的一些基本特征：發病年齡早，通常小于25歲(該患者初診年齡為23歲)；BMI通常小于25 kg/m2；家族中一級親屬有糖尿病病史；空腹血糖濃度輕度升高，通常在5.5～8.3 mmol/L之間，并且多年無惡化進展，糖化血紅蛋白小于7.5%。

本研究存在自身的局限性：①由于樣本來源于回顧性研究數據，因此對患者的隨訪十分關鍵，一定比例的失訪導致本研究缺乏一些樣本，因此這一結論需要在大規模的研究中證實。②由于缺乏足夠的陽性病例，很難評估篩選方法的效率。與其他人群中發病率差異類似，妊娠期血糖異常人群中GCK突變檢出率的差異可能與地區、種族、人群的基數、GCK患者篩查標準等因素有關。不同研究中的篩選方法不同，得出的結論[8]也存在差異，就中國妊娠人群而言，與往期的研究結論是一致的。③與以往研究中使用的標準相比，未使用糖化血紅蛋白對該項目進行限制，因此目標人群相對于以往研究[17]是增加的，這也是GCK突變的發生率低的一大原因。

本研究中基于3次空腹血糖和三酰甘油的嚴標準篩選方法，對于篩查中國人群中的MODY2是可行的。盡管有研究提出MODY2患者的血脂并未發現明顯異常，但在中國，低三酰甘油確實是MODY2患者的真實表現。中國妊娠期血糖異常人群中GCK突變發病率低，假設未被送檢的人群中GCK基因均無突變，那么估計中國人群中的 MODY2患病率約為1/2 454，約等于0.4‰，這個結論與以往研究[17]大致相符。因此筆者認為，GCK突變不是孕期血糖異常的主要致病原因。但由于中國人口眾多，這些人是不可忽視的。正確的篩查和診斷將有利于節約醫療資源，提供產前咨詢，提高患者的生活質量。