卵泡抑素樣蛋白1促進肺動脈內皮細胞增生、黏附與血管生成

沙宇惠 高 陽 劉 杰,2 齊先梅,2 韓璐璐 王 望,2*

(1.首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069； 2.首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，北京 100069)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension, PH)是指在海平面，平臥靜息狀態下，經右心導管測量平均肺動脈壓力超過20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的狀態[1]，其主要病變包括內膜增生、平滑肌增厚、外膜的纖維化改變以及管周炎性反應[2]。肺部疾病/低氧相關性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是PH臨床分類中的第三類，其發病機制與肺血管內皮細胞密切相關[3]。內皮細胞作為血管壁的屏障，發揮重要的內分泌功能[4]。一方面，低氧刺激將導致肺動脈內皮細胞功能失調，可引起血管活性物質和細胞因子分泌異常，作用于血管平滑肌細胞引起肺血管收縮和血管壁的重塑[4]；另一方面，肺動脈內皮細胞本身的異常增生與黏附、血管生成等功能的紊亂，亦是肺血管重塑的重要病理基礎[5-7]。

卵泡抑素樣蛋白-1(follistatin-like 1,FSTL1)是一種分泌型糖蛋白，又名轉化生長因子β1誘導蛋白36或卵泡抑素相關蛋白，在人和小鼠組織中廣泛表達，多由間質細胞系分泌[8-9]。近來多項研究[10-11]顯示，FSTL1可調節內皮細胞的功能。本實驗室的前期研究[9]顯示，在低氧性肺動脈高壓患者及動物模型中，FSTL1的表達上調。同時，FSTL1可通過抑制ERK信號通路改善低氧刺激下肺動脈平滑肌細胞的異常增生與遷移，從而改善肺血管重塑，延緩肺動脈高壓的發生發展[9]。然而，肺動脈內皮細胞功能紊亂作為HPH發生發展的始動因素[3]，FSTL1對其影響尚有待于研究。本文旨在研究FSTL1對人肺動脈內皮細胞增生、黏附、血管生成等功能的影響，為肺動脈高壓機制的研究提供一定的理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

人肺動脈內皮細胞(human pulmonary artery endothelial cells, HPAECs)購自美國ScienCell公司。

1.2 主要試劑與儀器

抗GAPDH抗體(兔源)購自美國CST公司；抗FSTL1抗體(山羊源)購自美國Santa Cruz公司；IRDye800CW標記山羊抗兔二抗及兔抗山羊二抗均購自美國LI-COR公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑均購自德國Roche公司；內皮細胞基礎培養基、生長因子、青霉素、鏈霉素、胎牛血清均購自美國ScienCell公司；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)均購自美國Sigma公司；重組人FSTL1蛋白購自美國R&D公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司；噻唑藍(MTT)購自美國Amresco公司；Opti-MEM培養基、脂質體轉染試劑(lipofectamine RNAiMAX Reagent)均購自美國Invitrogen公司；siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司；基質膠(matrigel)購自美國BD公司；纖連蛋白(fibronectin)購自美國Thermo公司；NanoDrop 2000 C分光光度計、細胞培養箱、生物安全柜均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；全波長光吸收酶標儀購自PerkinElmer公司；常壓低氧艙購自美國BioSpherix公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；電泳儀、電轉儀均購自美國Bio-Rad公司；Odyssey紅外成像系統購自美國LI-COR公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 內皮細胞培養

將HPAECs培養于25 cm2培養瓶中，添加內皮細胞完全培養基培養，控制無菌培養箱內溫度為37℃，CO2濃度為5%。在常氧實驗時將O2濃度設為21%，低氧則為3%。

1.3.2 qRT-PCR檢測FSTL1 mRNA的表達

用Trizol提取人肺動脈內皮細胞的mRNA后，反轉錄成cDNA，再進行PCR循環擴增。PCR引物序列：FSTL1上游：5’-TCT GTG CCA ATG TGT TTT GTG G-3’；下游：5’-TGA GGT AGG TCT TGC CAT TAC TG-3’；GAPDH上游：5’-GGG TGT GAA CCA TGA GAA GTA TGA-3′；下游：5’-TGC TAA GCA GTT GGT GGT GC-3’。

1.3.3 Western blotting檢測FSTL1蛋白質的表達

提取人肺動脈內皮細胞蛋白，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)進行電泳，后通過轉膜把蛋白轉到Nitrocellulose filter(NC)膜上。用5%(質量分數)脫脂奶粉封閉液封閉NC膜1 h。4 ℃，一抗孵育過夜。次日，熒光二抗孵育1 h，洗膜，Odyssey紅外成像系統掃膜。

1.3.4 內皮細胞增生實驗

細胞培養至對數期后，在96孔板上以104個/孔的密度接種HPAECs，每組6個復孔；次日饑餓4 h后在常氧下用不同濃度的FSTL1(0、50、100、250、500 μg/L)處理；或饑餓4 h后在低氧下給予小干擾RNA轉染處理，24 h后棄去培養液，更換為100 μL/孔的MTT工作液，避光，37 ℃孵育4 h。吸棄MTT，加入100 μL/孔的DMSO溶劑，避光；15 min后在酶標儀上測定各孔的吸光度(波長為490 nm)。小干擾RNA序列：siRNA FSTL1上游：5′-GAA GAG CUA AGG AGC AAA UTT-3′；下游：5′-AUU UGC UCC UUA GCU CUU CTT-3′；siRNA NC (Negative control)：上游：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′；下游：5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。

1.3.5 內皮細胞黏附實驗

在96孔板每孔加入約30 μL纖連蛋白(20 μg/mL)，在常氧下將不同濃度FSTL1(0 μg/L、250 μg/L)處理24 h后的HPAECs胰酶消化，按104/孔的密度接種細胞于包被好的96孔板中，置于37 ℃培養箱中孵育30 min，棄去培養液，PBS洗去未貼壁細胞。每組5個復孔，隨機選擇5個視野(10×)，倒置相差顯微鏡照相，使用Image J軟件計數每個視野貼壁細胞，統計分析。

1.3.6 內皮細胞血管生成實驗

將24孔板于冰面上每孔加入200 μL基質膠，將對數生長期的HPAECs用胰酶進行消化，并稀釋重懸為含不同濃度FSTL1(0 μg/L、250 μg/L)的細胞懸液，按照105/孔的密度接種于包被好的24孔板中，置于常氧培養箱中培養24 h。每組2個復孔，隨機選擇5個視野(4×)，倒置顯微鏡下照相，使用NIS-Elements圖像處理軟件測量新生血管長度和小管數，統計分析結果。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 低氧可上調人肺動脈內皮細胞FSTL1的水平

本實驗采用低氧[3%(體積分數)O2，5%(體積分數)CO2]刺激HPAECs，分別在低氧刺激后0、6、12、24 h提取HPAECs的mRNA和蛋白質，應用qRT-PCR和Western blotting的方法分別檢測FSTL1的mRNA和蛋白質水平。qRT-PCR的結果顯示，相對于0 h組(1.00±0.25)，低氧刺激HPAECs 6 h后FSTL1的mRNA表達量有升高趨勢，低氧刺激12 h和24 h后 FSTL1的mRNA表達量分別為(1.92±1.04,P<0.05)和(2.41±1.25,P<0.001)(圖1A)，即分別提高到0 h組的1.92倍與2.41倍，提示低氧可上調HPAECs中FSTL1 mRNA的表達(F=8.842,P<0.001)；Western blotting結果顯示，與0 h組(1.00±0.15)相比，低氧刺激HPAECs 6 h后FSTL1的蛋白質表達量有升高趨勢，低氧刺激12 h和24 h后FSTL1的蛋白質表達量分別為(1.22±0.15,P<0.05)、(1.31±0.16,P<0.01)(圖1B)，即分別提高到0 h組的1.22倍與1.31倍，提示低氧可上調HPAECs中FSTL1蛋白質的表達(F=6.138,P<0.01)。

圖1 低氧對人肺動脈內皮細胞表達FSTL1的影響Fig.1 Effect of exposure to hypoxia on expression of FSTL1 in HPAECsA: hypoxia-induced expression of FSTL1 mRNA (n=5); B: hypoxia-induced expression of FSTL1 protein (n=6). Data were presented as Mean ±SD.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs 0 h group; FSTL1:follistatin-like 1; HPAECs:human pulmonary artery endothelial cells.

2.2 FSTL1可促進人肺動脈內皮細胞的增生

圖2 FSLT1對人肺動脈內皮細胞增生活性的影響Fig.2 FSTL1 promotes proliferation of HPAECs and SiRNA-mediated knock down of FSTL1 attenuates hypoxia-induced proliferation of HPAECsA:Effect of FSTL1 of different concentrations on cellular viability of HPAECs under normoxia in MTT assay (n=6).B：Effect of FSTL1 siRNA transfection on cellular viability of HPAECs under hypoxia in MTT assay (n=4). Data were presented as Mean±SD. ** P<0.01 vs 0 μg/L group, △△△P<0.001 vs siRNA N.C. group; MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; SiRNA: small interfering RNA; N.C.:negative control; FSTL1: follistatin-like 1.

采用MTT實驗觀察FSTL1對HPAECs增生活性的影響。常氧下，采用重組人FSTL1蛋白(0、50、100、250、500 μg/L)外源性刺激細胞24 h后檢測增生活性。與0 μg/L組(1.00±0.19)相比，50和100 μg/L組的細胞增生活性有所增加，250 μg/L和500 μg/L組的細胞增生活性分別為(1.35±0.47,P<0.01)和(1.36±0.61,P<0.01)(圖2A)，即分別提高到0 μg/L組的1.35倍與1.36倍，提示常氧下FSTL1可促進HPAECs的增生(F=3.774,P<0.01)。而在低氧條件下采用小干擾RNA(siRNA)轉染，敲低HPAECs中FSTL1的表達，于次日檢測HPAECs的增生活性。與對照組(1.00±0.06)相比，干擾組HPAECs增生活性為(0.84±0.10,t=7.375,P<0.001)(圖2B)，降低到對照組的0.84倍。提示FSTL1表達降低可抑制低氧刺激下HPAECs的增生。

2.3 FSTL1可增強人肺動脈內皮細胞黏附功能

筆者發現常氧下250 μg/L FSTL1對HPAECs的增生活性有明顯的促進作用，因此在后續實驗中選用250 μg/L這一濃度刺激HPAECs。常氧條件下，分別采用0 μg/L和250 μg/L的FSTL1刺激HPAECs，24 h后檢測FSTL1對HPAECs黏附能力的影響。結果顯示，250 μg/L FSTL1刺激24 h后HPAECs黏附數量為(269±17)，與對照組(244±10)相比，提高1.10倍,差異有統計學意義(t=5.921,P<0.001)(圖3)，提示FSTL1可促進HPAECs的黏附。

2.4 FSTL1可增強人肺血管內皮細胞的血管生成功能

常氧條件下，于包被好基質膠的24孔板上按105/孔接種HPAECs，分別給予0 μg/L和250 μg/L的FSTL1，24 h后測量小管長度與數目。結果顯示，250 μg/L FSTL1刺激下HPAECs生成血管的長度為(1.12±0.10)，與對照組(1.00±0.09)相比提高1.12倍，差異有統計學意義(t=5.677,P<0.001)(圖4A)；新生血管數目為(36.61±8.77)，與對照組(28.75±5.24)相比提高了1.27倍，差異有統計學意義(t=5.105,P<0.001)(圖4B)，提示FSTL1可促進HPAECs血管生成。

3 討論

肺動脈高壓往往用于描述一組以肺血管重構以及肺動脈壓力進行性升高為特征的罕見病癥[1]。根據病因可將肺動脈高壓分為五大類：動脈性肺動脈高壓；左心疾病相關性肺動脈高壓；肺部疾病/低氧相關性肺動脈高壓；慢性血栓栓塞性肺動脈高壓；未明機制的肺動脈高壓[12]。其中，肺部疾病/低氧相關性肺動脈高壓，尤其是慢性阻塞性肺疾病與纖維性肺疾病，是肺動脈高壓的第二大發病群體，僅次于左心疾病相關性肺動脈高壓[13]。該類患者多因長期缺氧而逐漸發展為肺動脈高壓[14-15]。因此，低氧是肺動脈高壓的重要誘因[16]。

圖3 FSTL1增強人肺動脈內皮細胞黏附功能Fig.3 FSTL1 promotes adhesion of HPAECsEffect of FSTL1 on cellular adhesion of HPAECs in culture plate wells under normoxia. Adherent cells were counted and expressed as the numbers of cells per high power field (5 wells for each group, and 6 HPFs in each well were counted, n=4). Data were presented as Mean±SD. ***P<0.001 vs 0 μg/L group; FSTL1:follistatin-like 1; HPAECs:human pulmonary artery endothelial cells.

圖4 FSTL1增強人肺動脈內皮細胞血管生成功能Fig.4 FSTL1 promotes angiogenesis of HPAECsSpontaneous formation of capillaries (angiogenesis) by HPAECs cultured with FSTL1 under normoxia. The results are expressed as the mean total tube lengths (percentages of medium control values) and numbers of tubes per field, respectively (n=4).Data were presented as Mean±SD. *** P< 0.001 vs 0 μg/L group; FSTL1:follistatin-like 1; HPAECs:human pulmonary artery endothelial cells.

肺血管重塑作為低氧性肺動脈高壓發病的重要環節，可導致肺血管阻力進行性升高[5]，其主要病變包括內膜增生、平滑肌增厚、外膜的纖維化改變以及管周炎性反應[2]。其中，血管內膜的異常增生及黏附、血管生成等功能紊亂在低氧所誘導的肺血管重構中具有重要意義。低氧可促進血管內皮細胞過量表達血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、VEGF受體以及低氧誘導因子-1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)，引起內膜過度且雜亂地增生，形成叢狀病變，成為內膜閉塞性病變的前兆[5]。同時，低氧所誘導的HPAECs黏附與血管生成功能的增強在肺血管重塑中發揮了重要作用，促進了肺動脈高壓的發生發展[17-18]。

FSTL1是一種分泌型糖蛋白，在心血管疾病、癌癥、肺部疾病等及個體發育過程中產生一定的影響[10,19]。有研究[11]顯示，在后肢缺血小鼠模型中骨骼肌細胞FSTL1表達量明顯上調，并可促進血管內皮細胞的存活、遷移和分化為網狀血管結構[11]。肺癌患者FSTL1的低表達與預后不良顯著相關，FSTL1可通過骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4, BMP4)/Smad1/5/8信號通路抑制肺腺癌細胞的生長[20]。同時，在矽肺患者與小鼠的肺組織中FSTL1表達增強，作為硅致肺損傷中重要的促炎和促纖維化因子[21]，FSTL1可通過TGF-β1/Smad2/3信號途徑促進肺纖維化發生發展[22]。本實驗室前期研究[9]結果表明，FSTL1在PH小鼠模型中表達升高，并通過抑制細胞外調節蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases, ERK) 信號通路抑制人肺動脈平滑肌細胞的增生和遷移。而肺動脈內皮細胞功能紊亂作為HPH發生發展的重要環節[3]，本研究側重于FSTL1對內皮細胞功能的影響。在本研究中，筆者給予低氧刺激肺動脈內皮細胞[3%(體積分數) O2、5%(體積分數) CO2]，分別在刺激后0、6、12、24 h提取肺動脈內皮細胞的mRNA與蛋白質，結果顯示，低氧刺激FSTL1的基因和蛋白質水平于6 h即升高，而于12 h、24 h顯著增加。此結果顯示，低氧可上調內皮細胞中FSLT1的表達且呈時間依賴性增加。

內皮細胞功能異常是肺血管重塑的始動因素。為了研究FSTL1對內皮細胞功能的影響，本實驗首先從正反兩方面觀察其對人肺動脈內皮細胞增生的影響。常氧條件下給予不同濃度的FSTL1外源刺激人肺動脈內皮細胞，結果顯示，50 μg/L和100 μg/L的濃度下FSTL1細胞增生活性即有所增加，而在250 μg/L的濃度下FSTL1可顯著促進HPAECs的增生并達最大效應，隨著劑量的增加，細胞增生活性未有顯著提高，結果提示常氧下FSTL1可促進HPAECs的增生；然后，筆者在低氧條件下給予小干擾RNA內源干擾內皮細胞FSTL1的表達，結果提示，HPAECs增生活性明顯下降。以上結果表明，FSTL1可促進HPAECs的增生。有研究[10]顯示，FSTL1可抑制臍靜脈血管內皮細胞的增生，并促進其遷移與侵襲；也有研究[23]表明，FSTL1可促進低氧誘導下間充質干細胞的存活與增生，這提示FSTL1對不同細胞的增生活性有著不同的作用。

內皮細胞功能異常還表現在黏附和血管生成能力的改變。接下來，本實驗進一步觀察了FSTL1對人肺動脈內皮細胞黏附和血管生成能力的影響。常氧條件下外源給予FSTL1刺激后檢測HPAECs的黏附水平，結果顯示，黏附數量有所增加，提示FSTL1可促進HPAECs的黏附。相關研究[24]顯示，FSTL1可促進結腸癌上皮細胞的黏附，這與本實驗結果相符。常氧條件下外源給予FSTL1刺激后檢測HPAECs的血管生成水平，結果顯示，小管的長度和數量均有所增加，提示FSTL1可促進HPAECs的血管生成。有研究[23]表明，FSTL1過表達的間充質干細胞可明顯促進心肌梗死后新生血管的形成，這與筆者的研究結果一致。

FSTL1作為骨形成蛋白4 (bone morphogenetic protein 4, BMP4) 的拮抗劑，有研究[25]顯示，其通過抑制BMP4/Smad1/5/8信號通路的磷酸化激活從而促進腦膠質瘤細胞的增生。此外，有研究者[26]認為，FSTL1是心血管系統重要的血管生成因子，其可通過TGF-β/Smad2/3信號通路誘導心肌梗死后的血管再生。而FSTL1是否通過上述信號通路促進人肺動脈內皮細胞的增生、黏附與血管生成功能尚有待于進一步研究。

肺動脈內皮細胞的增生、黏附、血管形成等功能紊亂是低氧誘導下肺血管重塑的重要病理生理基礎，筆者的實驗結果證明，低氧可刺激HPAECs上調FSTL1的表達，而FSTL1又可促進HPAECs增生、黏附以及血管生成。從而為肺動脈高壓的預防和治療提供新的思路和作用靶點。