普通凍藏溫度下金槍魚生魚片中特定腐敗菌篩選及貨架期預測模型研究

馬錦濤，霍健聰

（浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316022）

金槍魚(tuna)是一種大型遠洋性重要商品食用魚，金槍魚肉色鮮紅，生活海域水體高度凈潔，使其成為一類肉味鮮美，營養豐富，食用安全性高的高品質海水魚，被國際營養學會列為世界三大營養魚類之一[1-3]。近年來，隨著我國漁業不斷向遠海進發，金槍魚已成為國內遠洋漁業的重要捕撈對象，浙江舟山建立了國內規模最大的“中國南方金槍魚交易中心”，并形成了以舟山為中心，輻射長三角地區的金槍魚捕撈、運輸、交易和加工中心，金槍魚魚片等產品已成為浙江省特色農產品之一。

目前，生魚片是金槍魚的主要加工產品，金槍魚魚片品質的有效保持依賴于覆蓋加工、運輸和銷售全程的超低溫冷鏈。由于技術和經濟等原因，國內金槍魚加工產業尚不能實現加工鏈中超低溫冷鏈的全程覆蓋，部分企業的金槍魚魚片產品在運輸、銷售過程中由于部分冷鏈環節溫度升高而發生魚片品質變差，甚至發生腐敗變質，不僅引起重大經濟損失，也給食品安全帶來重大隱患。本研究旨在通過對金槍魚魚片中主要腐敗菌的分離篩選，明確引起金槍魚魚片發生腐敗變質的主要微生物，并初步建立基于溫度的金槍魚生魚片的貨架期預測模型，以期為金槍魚魚片的保藏提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金槍魚魚片：由寧波大洋世家水產有限公司提供，原料為大眼金槍魚Thunnus obesus 選魚體背部赤身部位；原料裝入含有經超低溫冰箱預凍結的冰袋的泡沫箱后，2 h 內運至實驗室，并放在超低溫冰箱中，備用。

1.2 主要設備及型號

超凈工作臺(SW-CJ-1D，蘇州凈化)；微生物培養箱(HWS-150，上海森信實驗儀器有限公司)；壓力蒸汽滅菌器(LDZM-40L-III，上海申安醫療器械廠)；生物顯微鏡(奧林巴斯BX-51，日本奧林巴斯)；超純水機(BDP-GS，南京權坤生物科技有限公司)；色差儀(CS-810，杭州彩譜科技有限公司)；其余均為試驗室常用設備，所用的培養基及化學試劑均購自國藥集團上海化學試劑有限公司，化學試劑為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 揮發性鹽基氮(TVBN)的確定

樣品從超低溫冰箱中取出后，切成4 cm×4 cm×0.5 cm 規格的魚片，放在PE 保鮮膜覆蓋的泡沫盒中，置于0、-10 和-18 ℃條件下貯藏，定期取出測定TVBN，TVBN 的測定參考GB/T 5099.44-2003。

1.3.2 菌落總數的確定

樣品處理參照1.3.1。菌落總數的測定方法以GB/T 4789.2-2008 為標準。

1.3.3 色差測定

生魚片色差測定采用色差儀。測定結果采用亮度L*、黃度b*、紅度a*和ΔE 表示，其中L*值越大則魚片亮度越大；a*值越大表示魚片紅色越深，a*值小則偏向綠色；b*值則指征魚片的黃色程度，數值大表明黃色深，反之則表明藍色深度大；ΔE 表示總色差，ΔE 越小表明魚片色澤越好。

其中ΔL*，Δa*，Δb*表示處理組同空白之間的差，以超低溫冷凍的金槍魚生魚片為空白。

1.3.4 生魚片貨架期的確定

食品貨架期是指在推薦條件下貯藏的食品，能保持高度的食品安全以及良好的感官和理化性質等特性的時間。本研究參考上海市地方標準《生食動物性海水產品(DB31/2013)》和國家標準《鮮、凍動物性水產品衛生標準(GB 2733-2005)》，菌落總數超過105CFU·g-1或TVBN 超過30 mg·100-1·g-1時可看做貨架期終點。

1.3.5 生魚片菌相的確定[4,9]

從1.3.2 的平板上挑取單菌落進行純化分離，而后對單菌落進行生化特征分析。

1.3.6 生魚片貨架期方程的構建[5]

首先構建生魚片腐敗微生物的生長曲線模型，具體采用修正的Gompertz 方程：

式中，t 是培養時間(h)；N(t)是培養到t 小時的菌落總數；N0和Nmax分別是初始的菌落總數和菌落總數極值(Log cfu·g-1)；μmax是最大比生長速率(h-1)；Lag 意為微生物生長的遲滯時間(h)。將各種實驗條件下測得的時間(t)和對應的菌數值logN(t)和方程通過Marquardt 迭代法進行擬合，得到logN0和logNmax，而后得到μmax和Lag，最終確定實驗條件下的微生物生長模型，最后利用該生長模型構建基于Gompertz 方程的貨架期模型：

式中，SL(h)是該方程預測的貨架期，Ns為菌落總數極值。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下金槍魚生魚片TVBN 的變化

圖1 是金槍魚生魚片不同溫度下TVBN 的變化。生魚片的初始TVBN 含量僅為6 mg·100-1·g-1左右，是新鮮魚片的標志，但隨著實驗時間延長，溫度對生魚片TVBN 的影響很大。從圖中可以看出，盡管3 個貯藏溫度下TVBN 均呈現上升趨勢，但溫度越高，上升幅度越大，其中0 ℃條件下的生魚片僅過了6 d 即超過30 mg·100-1·g-1，被認為發生了腐敗變質，而-10 ℃條件下的魚片達到變質的時間為10 d，-18 ℃組的魚片則在整個實驗過程中始終未超標。

圖1 魚片貯藏過程中TVBN 的變化Fig.1 Changes of TVBN during the storage of sashimi

2.2 不同溫度下對生魚片菌落總數的影響

圖2 是不同溫度對金槍魚生魚片菌落總數的影響。從圖2 可知，菌落總數的增長同溫度緊密相關，溫度越高，則菌落總數增長數量越多，速度越快。0 ℃條件下的生魚片第6 d 時已經達到7 log，已經達到腐敗標準，而-10 ℃魚片組達到腐敗的時間則為第10 d，-18 ℃魚片組在第14 d 時才接近腐敗標準。從菌落總數和時間的關系來看，與TVBN 的變化趨勢大致相同。因此，考慮到TVBN 指標，將金槍魚生魚片的貨架期分別確定為14 d(-18 ℃)、10 d(-10 ℃)和6 d(0 ℃)。

圖2 貽貝貯藏過程中菌落總數的變化Fig.2 Changes of total numbers of colony during the storage of sashimi

2.3 不同溫度對金槍魚生魚片色度的影響

金槍魚鮮艷的紅色不僅是金槍魚生魚片的重要商品價值標志，也是金槍魚鮮度的重要指標。從表1 可以看出，不同處理組樣品在達限時間時色度同空白相比差異顯著，保存時間越長、貯藏溫度越高，則色度越差，其中0 ℃貯藏魚片的紅度達到26.8，肉色呈現非常黯淡的深紅發黑，而-18 ℃貯藏的魚片同空白相比，除黃度外，亮度、紅度都差異較小，外觀差異不大。

表1 不同溫度處理條件下魚片達限時間的色度Tab.1 The chroma of sashimi at the end of storage with different temperature

2.4 金槍魚生魚片中主要微生物的分離及種屬鑒定

表2 是從金槍魚生魚片(-18 ℃)中分離純化并經生化鑒定后所得的微生物種類。從表2 中可知，分離得到的微生物共有10 個種屬，包括假單胞菌屬、腸桿菌屬等，其中假單胞菌屬數量最多(56 株)，占總菌株的58%。金槍魚生活環境水體高度凈潔，微生物種類相對簡單，但捕撈運輸過程中極易受到二次污染，造成金槍魚魚體上微生物種類繁雜；捕撈后的金槍魚的貯藏環境通常都處于超低溫環境(-60 ℃)，超低溫運輸過程中部分微生物死亡，菌相又發生巨大變化，幸存下來的微生物能夠適應低溫環境，并可繼續生長繁殖并造成魚體腐敗，這種微生物稱為特定腐敗微生物[6]。圖3是不同溫度條件下生魚片到達貯藏終點時的微生物種屬結果，結果顯示不同實驗組達限時間的微生物菌屬數量相同，且均以假單胞菌屬數量最多，這一結果與南美白對蝦中的微生物分布類似[7,10]。其中0 ℃組中假單胞菌屬比例達到62%，且該組的魚片也可以明顯感到腐敗氣味，因而將假單胞菌屬確定為金槍魚生魚片的特定腐敗微生物。藍蔚青[8]等同樣以大眼金槍魚為原料，對其冷鏈和斷鏈兩種保藏條件下的微生物進行了分離鑒定，從中分離出希瓦氏菌數、假單胞菌數等12 種微生物，且以熱死環絲菌屬、假單胞菌數和嗜冷桿菌屬為優勢腐敗微生物。這同本研究結果不同，可能是由于樣品選取部位不同導致。

圖3 不同溫度條件下貽貝貯藏終點時微生物菌相Fig.3 The bacteriological phase of sashimi at the end of storage with different temperature

表2 金槍魚生魚片中主要微生物Tab.2 Main microorganism in tuna sashimi

2.5 普通凍藏條件下金槍魚生魚片貨架期模型的建立

2.5.1 魚片凍藏過程中特定腐敗微生物的變化

圖4 是利用假單胞菌專屬培養基對魚片凍藏過程中的假單胞菌屬微生物進行測定的結果。從圖中可以看出，在達限時間內，各實驗組中假單胞菌屬微生物的對數值分別為3.88(-18 ℃)、4.46(-10 ℃)和5.82 d(0 ℃)。

圖4 不同溫度下貽貝中假單胞菌屬數量變化Fig.4 Changes of Pseudomonas in sashimi with different temperature

2.5.2 不同溫度下生魚片中生長模型的構建

將2.5.1 的生魚片中微生物生長的相關數據同Gompertz 方程進行擬合修訂，利用Marquardt 迭代法，通過非線性回歸獲得不同處理條件下生魚片中微生物的生長參數。

將表3 中的相關數據帶入生長模型方程，得到不同處理條件下假單胞菌屬微生物的生長模型。

表3 生魚片在不同溫度下假單胞菌屬生長參數Tab.3 Growth parameters of Pseudomonas in sashimi with different temperature

-18 ℃條件

-10 ℃條件

0 ℃條件

2.5.3 不同處理條件下魚片冷藏貨架期模型

表4 是不同處理條件下魚片到達貨架期終點時的Ns和Nmax值。

表4 不同處理條件下魚片組的Ns 和Nmax 值Tab.4 Ns and Nmax of different treatment of sashimi

構建-18～0 ℃金槍魚生魚片凍藏貨架期時將Ns和Nmax取平均值后帶入方程，得到貨架期方程如下：

貨架期方程建立后，實驗人員又對其準確性進行了驗證，將金槍魚生魚片置于-5 ℃和-12 ℃溫度下進行凍藏，通過檢驗初始菌落數(2.04×103CFU·g-1和2.0×103CFU·g-1)，帶入貨架期方程后得到其預測貨架期為7.24 d 和11.68 d。試驗期間每日檢測樣品菌落總數，結果為當時間分別為170 h 和275 h 時菌落總數超標，因而，該方程對于預測金槍魚生魚片的非超低溫冷凍溫度范圍內的貨架期具有較為準確的預測效果。

3 結論

金槍魚品質好，營養價值高，但保藏條件極為苛刻，需要全程的超低溫冷鏈。在當前國內超低溫冷鏈尚不能全程覆蓋的情況下，溫度波動會引發腐敗微生物生長，引起魚片色澤變差、營養價值和商品價值降低、產生食品安全隱患。本研究以此為出發點，篩選和確定了大眼金槍魚赤身部位的特定腐敗微生物，并對魚片進行了低溫冷凍范圍的貨架期預測進行了研究，結果表明假單胞菌屬微生物是金槍魚生魚片的主要腐敗微生物，構建的貨架期預測模型能夠準確預測-18～0 ℃范圍內魚片貨架期。