基于網絡藥理學探討四君子湯防治酒精性肝病的作用機制*

黃 銘 王林燕 竇曉兵 杜仲燕#

1 浙江中醫藥大學生命科學學院 浙江 杭州 310053

2 浙江中醫藥大學中醫藥科學院 浙江 杭州 310053

酒精性肝病（ALD）是一種由于長期過度飲酒導致的脂肪性肝臟疾病。近年來研究顯示，我國酒精性肝硬化占肝硬化發病總數的比例呈逐年上升態勢[1-2]。然而ALD的臨床治療缺乏理想用藥，中醫中藥正受到肝病學界的廣泛關注。1992年，中國中醫藥學會肝病委員會制定了脂肪肝的辨證分型標準，且經過臨床統計發現以肝郁脾虛型患者較多[3]。因此，益氣健脾在ALD的治療中非常重要，四君子湯是益氣健脾的代表方，據臨床報道，運用四君子湯加減治療ALD療效顯著，未發現明顯的副作用[4-5]。但作用機制尚未得知，仍亟需解決。本研究通過網絡藥理學方法，對四君子湯多成分-多靶點-多通路防治ALD的復雜網狀關系進行研究，旨在為揭示四君子湯作用機制的科學內涵提供參考。

1 資料與方法

1.1 網絡藥理學工具：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）獲取四君子湯活性成分及靶點；TTD數據庫、Drugbank數據庫、DisGeNET數據庫獲取酒精性肝病靶點；基因相互作用檢索工具STRING數據庫進行PPI分析；Venny2.1工具映射共同靶點并繪制韋恩圖；Cyto‐scape3.7.0軟件構建網絡，并通過其ClueGO插件進行GO和KEGG分析。以上工具的使用時間截止至2019年7月。四君子湯防治ALD的研究路線圖見圖1。

圖1 四君子湯防治ALD的研究路線圖

1.2 四君子湯主要活性成分以及靶點預測：本研究通過 TCMSP數據庫，以 REN SHEN，GAN CAO，FU LING，BAI ZHU為關鍵詞，檢索四君子湯的全部化學成分。并基于TCMSP數據庫中ADME參數對化學成分進行篩選，主要采用口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%及類藥性指數（Drug-like Index，DL）≥0.18這兩項指標作為篩選標準。隨后逐一收集有效活性成分的潛在靶點，再通過Unipot數據庫對靶點名稱進行標準化。

1.3 ALD相關靶點獲取：通過TTD、Drugbank和Dis‐GeNET數據庫以“Alcoholic Liver Disease”為關鍵詞檢索獲取ALD疾病相關的靶點，并去重。

1.4 四君子湯防治ALD的靶點映射：通過Venny 2.1獲取四君子湯防治ALD的靶點交集，并將交集的靶點導入Cytoscape軟件中構建“四君子湯-防治ALD靶點-對應活性成分”可視化網絡圖。

1.5 成分-靶點和蛋白-蛋白互作網絡分析：為探索靶點蛋白之間的相互作用，將四君子湯防治ALD的靶點上傳至STRING數據庫中，獲取PPI網絡，再通過R語言分析STRING中獲取的文件，并繪制Barplot圖。

1.6 GO和KEGG分析：把四君子湯防治ALD的靶點上傳至Cytoscape的ClueGO插件，進行GO功能注釋和KEGG信號通路的富集分析(P＜0.01)。

2 結果

2.1 四君子湯活性成分篩選：通過檢索TCMSP數據庫Ingredients選項，并根據OB≥30%，DL≥0.18篩選各獲得人參22個、白術7個、茯苓15個和甘草92個活性成分，去重后，獲得四君子湯135個活性成分。

2.2 四君子湯靶點預測：根據獲取的135個活性成分，再通過TCMSP數據庫，逐一獲取相對應的靶點，結果顯示人參對應靶點有256個（其中5個活性成分無靶點信息），白術有23個（其中3個活性成分無靶點信息），茯苓有30個，甘草有1769個，去重后共為258個潛在靶點。在Uniprot數據庫中標準化后，獲得214個預測靶點。通過檢索TTD、DrugBank、DisGeNET數據庫，各檢索獲得ALD相關靶點0個、16個、84個，去重后共100個靶點，與藥物靶點映射，共得到21個四君子湯防治ALD的靶點（圖2和圖3）。

圖2 四君子湯防治ALD對應靶點

圖3 四君子湯防治ALD具體靶點

2.3 PPI網絡的構建：為了更好地理解四君子湯防治ALD的作用機制，基于PPI關系，利用STRING數據庫構建了四君子湯防治ALD相關靶點的PPI網絡（圖4）。PPI網絡包含21個蛋白質節點，81條相互作用關系（連線），其中1個蛋白質節點無相互作用關系。再通過R語言計算靶點的degree，并繪制Barplot圖，顯示IL1B、IL6、CCL2、CXCL8、IL10、STAT3、NFE2L2、PPARG、SPP1、NR3C1為排名前10的核心靶點（圖5）。

圖4 四君子湯防治ALD靶點的PPI網絡

圖5 四君子湯防治ALD排名前10的核心靶點

2.4 網絡構建及分析：使用Cytoscape軟件構建ALD-四君子湯活性成分-作用靶點的網絡模型，如圖6所示。從圖中可以看出，68個活性成分的21個潛在治療靶點對比到ALD上，不同的活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，根據Degree值篩選，排名前2的活性成分分別為quercetin（槲皮素，18）、kaemp‐ferol（山萘酚，15）、licochalcone a（利可考酮，4）、naringenin（柚皮苷，4）、formononetin（福莫寧，4）、isorhamnetin（異鼠李素，4）；排名前3的靶點為PPARG（69）、MAPK14（48）、GSTP1（5）。

圖6 四君子湯防治療ALD的靶點-成分網絡關系圖

2.5 候選靶基因功能分析：根據四君子湯防治ALD相關的靶基因，通過Cytoscape軟件的ClueGO插件進行GO生物學功能和KEGG信號通路的富集分析，發現參與調節RNA聚合酶Ⅱ轉錄pri-miRNA、急性炎癥反應的調節、過氧化氫的生物合成過程等9個功能組被顯著富集，其作用涉及脂質儲存的負調控、脂質儲存、急性炎癥反應的調節等生物學功能的調控（圖7）。KEGG信號通路富集發現，主要和糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、細胞色素P450對異生物的代謝、IL-17信號通路、TNF信號通路、PPAR信號通路等信號通路相關（圖8）。

圖7 四君子湯治療ALD的GO生物功能富集結果

圖8 四君子湯防治ALD的KEGG信號通路富集結果

3 討論

ALD雖然致病因素單一，但致病機制復雜，目前認為細胞損傷、氧化應激、代謝異常、炎癥、免疫損傷等均可導致ALD，臨床尚缺乏安全有效的藥物[6]。中醫古籍中“傷酒”“酒疸”等描述與ALD十分相似，臨床統計發現以肝郁脾虛型患者較多。四君子湯始載于《太平惠民和劑局方》，由人參、甘草、茯苓、白術四味藥組成，是益氣健脾的簡易名方[7]。臨床研究發現四君子湯加減治療ALD療效顯著；動物實驗研究表明，四君子湯對急性酒精肝損傷模型具有較好的治療效果[8]。

為了系統探討四君子湯防治ALD的具體機制，本研究通過網絡藥理學方法，采用TCMSP平臺篩選出四君子湯防治ALD的活性成分135個，有槲皮素、山奈酚、迪奧普、豆甾醇、β-谷固醇、菊黃素、鬼臼胺等成分直接、間接地作用于CCL2、CXCL8、IL10、STAT3、PPARG等靶點，涉及脂質儲存的負調控、脂質儲存等GO生物學功能，涉及PPAR、IL-17、TNF等信號通路。

本研究使用Cytoscape軟件構建活性成分-作用靶點網絡篩選得到排名前2的核心活性成分為槲皮素和山奈酚。多項研究證實，槲皮素可改善ALD小鼠的氧化損傷、細胞凋亡以及肝脂肪變性，機制可能與調節脂質吞噬[9]等相關。山奈酚可顯著降低ALD小鼠氧化應激以及脂質過氧化水平，并增加抗氧化防御活性，可能與降低肝臟CYP2E1的表達水平和活性有關[10]。

本研究根據STRING和Cytoscape篩選核心靶點，排名前1的為PPARG。PPARG是過氧化物酶體增生激活受體γ，在脂質代謝和預防氧化應激中具有重要作用[11]，肝臟內的PPARγ可促進肝臟脂肪變性及炎癥，從而導致酒精誘導的肝損傷[12]。GO生物學功能富集分析也發現與脂質代謝、脂質調控、炎癥反應密切相關。KEGG信號通路富集分析亦發現與PPAR信號通路密切相關。氧化應激和脂質過氧化是ALD的重要發病機制，由此推測四君子湯主要通過作用上述受體及對應信號通路來防治ALD。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學的方法，驗證了四君子湯多成分-多靶點-多途徑治療ALD的作用特點，預測了四君子湯防治ALD可能與脂質代謝、脂質調控、炎癥反應等相關，涉及的通路有PPAR信號通路、TNF信號通路等，核心靶點可能是PPARG，為后續實驗驗證提供了思路和依據，也為闡明四君子湯防治ALD的機制提供新思路和新方法，更為四君子湯這一中醫經典方的現代臨床應用提供依據。