丹栝方對糖尿病動脈粥樣硬化大鼠糖脂代謝及活性氧、胸主動脈核因子κB表達及其mRNA表達的影響

歐陽金明 楊明華

1 浙江中醫藥大學 浙江 杭州 310053

2 浙江省中藥研究所 浙江 杭州 310016

筆者通過實驗研究，分析丹栝方對糖尿病動脈粥樣硬化大鼠糖脂代謝及活性氧（ROS）、胸主動脈核因子κB（NF-κB）及其mRNA表達的影響。結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：選擇我院實驗中心提供的80只雄性SPF級糖尿病GOTO-KAKIZAKI大鼠作為研究對象，糖尿病均為自發，均為13周齡，平均體質量346.98±25.13g；同時選擇我院實驗中心提供的20只雄性SPF級Wistar大鼠開展研究，均為13周齡，平均體質量362.85±12.37g。根據每籠5只將大鼠獨立飼養在通氣籠具系統中，設定溫度21～23℃，濕度45.0%～55.0%，飼料配方：由實驗中心提供普通飼料，高脂飼料由2.00%膽固醇、87.63%普通飼料、0.07%丙基硫氧嘧啶、10.00%精煉豬油和0.30%豬膽鹽構成。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 藥物：丹栝方屬中藥方劑，配伍嚴謹，方劑組成如下：丹參、白僵蠶9g，瓜蔞（栝蔞）12g，川芎、郁金、薤白各10g，赤芍6g。加水煎煮成1g/ml丹栝方藥液（內含原生藥1∶1）。辛伐他汀（杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字J20180007，20mg/片）配制為懸濁液，濃度0.25mg/ml。二甲雙胍（山東力諾制藥有限公司，國藥準字H37023557，0.25g）準確配制為懸濁液，濃度18.75mg/ml。

1.2.2 造模：取80只GOTO-KAKIZAKI大鼠,2次快速血糖平均水平≥11.1mmol/L視作糖尿病成模大鼠。所有GOTO-KAKIZAKI大鼠給予高脂飼料喂飼，腹腔注射10mg/（kg?d）NOS抑制劑-L-NAME（N-硝基L-精氨酸甲酯），持續喂飼2周，介導動脈粥樣硬化發生。6個月后，于顯微鏡下觀察動脈形態。給予每只大鼠皮下注射2U/d諾和靈N，持續注射10d，結果顯示大鼠的易激惹癥狀不斷減輕。于第14d檢測血糖水平約為10mmol/L，停止胰

1.2.3 分組和干預方法：根據體質量對GOTO-KAK‐IZAKI糖尿病成模大鼠進行分層，依據血糖水平，按隨機數表法分成丹栝方組20只，應用8ml/（kg·d）丹栝方治療；二甲雙胍組20只，應用150mg/（kg·d）二甲雙胍治療；辛伐他汀組20只，應用2mg/（kg·d）辛伐他汀治療；模型組20只，給予8ml/（kg·d）無菌水喂飼；同期選擇20只同齡、同體質量Wistar大鼠納入正常對照組，給予普通飼料喂飼。在預實驗基礎上干預管理6個月后，各組大鼠不禁水但禁食12h獲取組織標本。

1.2.4 測定指標：對大鼠的毛發和精神狀態、食量、活動狀況、體質量等進行觀察。6個月后，各組大鼠均接受12h禁食，經腹腔注射0.3ml/100g的10%水合氯醛。麻醉后于腹部正中線位置剖開，分離腹主動脈血管，抽取血液10ml后置于3000r/min離心處理10min，提取血清，放于-20℃冰箱內凍存，待測。另抽取1ml血液，置于10%EDTA二鈉中混勻，經 3000r/min離心處理后提取血清，放于-20℃冰箱內凍存，備用。采集大鼠胸椎動脈弓組織置于4%多聚甲醛固定，實施HE染色；后將部分胸主動脈置入RNA液內進行保存，備用，檢測其mRNA。

1.2.5 檢測基礎指標：經全自動生化儀對大鼠的空腹血糖（FBG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）等指標進行監測，并經特定蛋白分析儀檢測糖基化血紅蛋白（HbA1c）表達水平；同時，經雙抗夾心酶聯免疫吸附法測定ROS表達，嚴格按試劑盒要求開展實驗操作，試劑盒每列設定8孔，并每組設8個標本。

1.2.6 免疫組化法檢測胸主動脈NF-κB陽性表達率：經免疫組化法測定胸主動脈NF-κB表達，嚴格按試劑盒要求實施操作，于顯微鏡下對細胞內陽性表達進行觀察，若分布棕黃色顆粒代表陽性細胞表達。

1.2.7 RT-PCR測定主動脈NF-κB mRNA陽性表達：經RT-PCR法測定主動脈NF-κB mRNA表達，包括提取總RNA、逆轉錄制備cDNA、設計/合成引物、RT-PCR擴增cDNA，所有操作均嚴格按說明書要求實施。經Rotor-Gene 6.0軟件依據反應的熒光對數據、標準品濃度進行實時監控，對CT值進行計算。

1.3 統計學處理：應用SPSS 23.0研究統計學數據進行處理，計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗；計數資料用n（%）表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基礎情況：各組大鼠接受干預前狀態表現良好，活潑好動且被毛光澤，但產生易激惹征象。實驗期間，辛伐他汀組、二甲雙胍組和模型組的大鼠分別死亡2只、4只、4只；丹栝方組和正常對照組大鼠未死亡。干預前各組大鼠的體質量對比，差異無統計學意義（P＞0.05）；但干預完成時模型組、丹栝方組、二甲雙胍組、辛伐他汀組GOTO-KAKIZAKI大鼠的體質量均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；相較于干預前，干預后模型組和丹栝方組大鼠的體質量增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；正常Wistar大鼠的體質量隨著觀察時間延長而顯著增高。見表1。

2.2 各組FBG和HbA1c：干預后模型組大鼠的FBG、HbA1c水平均高于正常對照組、丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 干預前后各組大鼠的體質量對比（±s，g）

表1 干預前后各組大鼠的體質量對比（±s，g）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與干預前比較，bP＜0.05。

干預后518.65±19.41b 374.53±23.55ab 368.24±30.97ab 357.62±30.89a 347.76±25.13a組別正常對照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組例數20 16 20 18 16干預前362.27±11.64 359.82±29.76 357.29±23.43 358.36±24.32 356.84±25.19

表2 干預后各組大鼠的FBG和HbA1c水平比較（±s）

表2 干預后各組大鼠的FBG和HbA1c水平比較（±s）

注：與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組HbA1c（%）5.52±0.26#9.23±1.07 7.38±0.91#8.40±0.79#7.74±1.03#例數20 16 20 18 16 FBG（mmol/L）3.04±0.47#10.78±0.73 6.25±1.11#7.49±1.85#6.37±0.69#

2.3 各組血脂指標和ROS水平：模型組大鼠LDL-C及TC、HDL-C水平均高于正常對照組；模型組大鼠LDL-C和TC、TG、ROS水平均高于丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組；丹栝方組大鼠LDL-C和TC、TG水平均低于二甲雙胍組；丹栝方組大鼠HDL-C水平高于辛伐他汀組，上述差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠干預24周后血脂指標、ROS表達水平對比（±s，mmol/L）

表3 各組大鼠干預24周后血脂指標、ROS表達水平對比（±s，mmol/L）

注：與模型組比較，#P＜0.05；與丹栝方組比較，eP＜0.05；與辛伐他汀組比較，fP＜0.05。

ROS 22.29±2.34 22.18±1.97 18.86±3.20#17.54±3.31#16.98±1.95#組別正常對照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組例數20 16 20 18 16 LDL-C 0.58±0.33#13.84±1.17 7.26±1.12#8.15±2.01#9.13±0.94#e TC 2.39±0.24#16.38±1.15 9.87±0.83#10.54±2.03#11.68±0.95#e HDL-C 0.75±0.16#2.11±0.18 2.41±0.13f 1.75±0.24 2.06±0.25 TG 1.99±0.52 1.73±0.16 0.79±0.22#1.27±0.25#1.02±0.37#e

表4 各組大鼠的NF-κB、NF-kB mRNA陽性表達率（±s，%）

表4 各組大鼠的NF-κB、NF-kB mRNA陽性表達率（±s，%）

注：與模型組比較，#P＜0.05；與二甲雙胍組比較，*P＜0.05。

NF-κB mRNA 20.17±3.28#43.94±0.52 32.18±0.23#*16.34±0.05#*36.85±0.31#組別正常對照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組例數20 16 20 18 16 NF-κB陽性表達1.49±0.31#10.82±0.83 6.20±0.86#6.73±0.79#6.92±0.73#

2.4 各組NF-κB、NF-κB mRNA陽性表達率：模型組大鼠NF-κB陽性表達率、NF-κB mRNA陽性表達率均高于正常對照組、丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組，差異有統計學意義（P＜0.05）；丹栝方組、辛伐他汀組大鼠的NF-κB mRNA陽性表達率均低于二甲雙胍組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 各組免疫組化法結果：于顯微鏡下觀察NF-κB陽性表達多處于中膜平滑細胞、內膜內皮細胞相關細胞核內，能發現褐色染色顆粒。正常組大鼠血管內膜偶見陽性表達；模型組呈強陽性表達，能見密集分布的褐色染色顆粒；而辛伐他汀組為陽性表達，內膜能發現分布較多褐色染色顆粒；但較弱于模型組；同時，丹栝方組、二甲雙胍組為弱陽性表達，能見散在分布的褐色染色顆粒。微量核酸-蛋白定量儀定量提取各組大鼠胸主動脈的總RNA發現，OC260/OC280值全部處于1.8～2.0范圍。

3 討論

近年來，隨著臨床深入研究氧化應激發現，促進患者血糖和血脂水平恢復正常，或是將氧化應激產生阻斷，將氧化應激產物消除，能有效降低氧化應激；但因氧化應激、肥胖、增齡、不良環境、吸煙和缺乏運動等相關因素影響，難以徹底消除氧化應激[1]。ACCORC（劃時代控制糖尿病心血管風險行動）研究結果顯示，開展嚴格的及強化的降壓和降糖、降脂干預，能有效減輕糖尿病大血管病變，預防或緩解糖尿病微血管病變[2]。研究數據發現，中醫藥的多靶點作用存在多效性特點，如丹栝方具有適度的氧化應激調控能力，能夠在降低患者糖代謝指標、改善患者血液黏度的基礎上，在預防心血管并發癥風險中亦能起到良好的作用[3]。研究結果表明，體內氧化應激因子是造成糖尿病患者并發動脈粥樣硬化綜合征的主要指標機制和影響因素；而血液中的高脂、高糖通過刺激代謝系統，分泌氧化應激因子，進而對糖尿病患者的血管內皮細胞造成永久性損傷[4]。相關研究指出，氧化應激為心血管疾病、胰島素抵抗及糖尿病等相關病變發生的基礎，故認為對氧化應激進行干預，能有效防治糖尿病和其血管并發癥[5]。

中醫學認為，糖尿病是一種氣血津液疾病，機體痰濁易生和代謝失調為糖尿病發生重要原因，長時間可導致痰瘀互結及脈絡失養。丹栝方作為中藥制劑，將方內丹參和栝蔞作為君藥，具有化痰活血的作用；其中丹參性寒能入營血，而栝蔞性寒、潤，兩者合用發揮活血化瘀、清熱祛邪、養護營陰等功效，達到標本兼治作用；方內川芎、赤芍、白僵蠶及郁金作為臣藥，能增強活血化瘀及祛邪作用；薤白等佐藥理氣散結、寬胸通陽。諸藥合用，能強化痰瘀同治及清潤通絡功效。相關研究顯示，赤芍多糖和川芎多糖均能清除自由基和超氧陰離子；丹參能抵抗大鼠動脈粥樣硬化，增加超氧化物歧化酶表達，減少丙二醛表達[6-7]。

研究結果發現，糖尿病患者體內高指標葡萄糖會通過人體代謝系統分解生成丙酮酸，而丙酮酸一旦通過三羧酸循環為線粒體呼吸鏈提供過多供氫體，會大幅增加體內生成活性氧[8]。活性氧作為人體主要細胞中的轉導因子，抑制三磷酸甘油醛脫氫酶活性，誘發心血管并發癥。藥理學研究顯示，丹栝方能使高糖培養的內皮細胞中ROS表達顯著降低[9]。本研究結果顯示，丹栝方能明顯減少高糖高脂動脈硬化模型大鼠循環血液內活性氧表達水平。丹栝方能發揮調脂和調糖作用，對高糖和高脂釋放的ROS進行抑制，并能對NF-κB的陽性表達、NF-κB mRNA表達進行調控，阻斷氧化應激引起的炎癥反應[10]。本研究表明，模型組大鼠NF-kB陽性表達率、NF-κB mRNA陽性表達率均高于正常對照組、丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組；丹栝方組、辛伐他汀組大鼠的NF-κB mRNA陽性表達率均低于二甲雙胍組；提示丹栝方能有效調節糖脂代謝，減輕氧化應激，預防糖尿病動脈粥樣硬化。

綜上所述，丹栝方可調節糖尿病動脈粥樣硬化大鼠的血糖和血脂，減輕氧化應激，改善糖尿病動脈粥樣硬化情況。但因糖尿病和動脈粥樣硬化的連接環節較為復雜，涉及抗炎、內皮細胞保護、細胞趨化、抗增殖和細胞黏附等情況，后期需開展深入研究。