光化學法誘導兔視網膜分支靜脈阻塞模型的初步探討

張佳良，桑子瑾，吳烈，吳文婷，張婷婷，張億

視網膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO) 是第二大致盲性眼底血管性疾病，其中視網膜分支靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)約占5/6，且其發病率仍在逐年增加［1］。由于BRVO 具體發病機制尚不明確，病程冗長，并發癥較多，嚴重影響視力，目前尚無有效治療方法[2]。通過建立合理的BRVO動物模型，對BRVO 的探索研究具有重要意義。目前建立實驗性BRVO 的模型有多種，不同實驗目的采用的方法和技術參數也不同，其中應用光化學法誘導該模型的研究較多，但技術操作未形成統一的標準化方案。為進一步完善操作技術，采用以熒光素鈉為光敏劑的光化學方法建立的新西蘭兔實驗性BRVO 模型，取得較滿意的結果，該造模方法操作簡單，眼底觀察方便，病理改變與臨床BRVO 相似，并通過對造模后連續觀測與單點觀測的結果比較，來驗證多次實驗外部干預是否會對模型病變及病程產生影響，為后期RVO 治療的相關實驗研究篩選出更好的造模方案，現總結介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇健康成年清潔級新西蘭兔40只（中國中醫科學院廣安門醫院實驗動物中心提供，許可證號SCXK（京）2014-0012），體重2.5～3.0 kg，兔齡12～16 個月，無眼疾患，雌雄兼用。動物實驗符合空軍軍醫大學動物倫理委員會標準。

1.1.2 主要試劑 戊巴比妥鈉（美國Sigma 公司）；熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司）；復方托吡卡胺滴眼液（北京雙鶴現代醫藥技術有限公司）；多聚甲醛（上海源聚生物科技有限公司）。

1.1.3 主要設備VISULAS 532s（德國ZEISS 公司）；光學相干斷層掃描儀（日本Topcon 公司）；眼底熒光血管造影儀（fluorescein fundus angiography，FFA）（德國Heidelberg 公司）；Olympus BX51 光學顯微鏡（日本OLMPUS 公司）。

1.2 動物分組

按照動物編號隨機分組，雌雄各半，第1組：8只，用于3、7、14 和21 d 的持續FFA 檢測；第2組：24 只，每個時間點6 只，分別于3、7、14 和21 d 不同時間點觀測FFA；第3組：8 只，不造模作為正常對照組。最后分別在7、14、21 和28 d 摘除兔眼球做病理切片。

1.3 模型建立

將實驗兔適應性喂養3 d 后造模，用復方托吡卡胺滴眼液點右眼散瞳至瞳孔直徑約5～6 mm，鹽酸利多卡因表面麻醉，按1 ml/kg 的劑量頭皮針經兔耳緣靜脈注入3%的戊巴比妥溶液麻醉并留置頭皮針，將實驗兔固定置于激光機前，放置三面鏡觀察眼底，經耳緣靜脈注射10%熒光素鈉注射液（0.3 ml/kg），找出與視網膜動脈相伴行的靜脈，應用532 激光，波長530 nm，能量100～300 mW，光斑直徑100～300 μm，持續時間0.2～0.5 s，光凝點選在距離視盤0.5 DD（視盤直徑長度）外的分支靜脈處。先以較小光斑小能量光凝靜脈選定點的遠端，然后光凝靜脈選定點的近端，見靜脈收縮局部變白血流中斷后，再以較大光斑大能量光凝兩點中央區，形成一段約1/3 DD 的靜脈血栓區域。每只實驗兔光凝右眼，根據需要分別光凝一側或兩側分支靜脈，每支靜脈平均光凝約30 點，同時避開伴行的動脈。

1.4 眼底影像學檢查

1.4.1 眼底彩色照相 實驗兔經激光光凝后，在靜脈麻醉狀態下置于OCT 儀前方固定好，以視盤為中心，找好角度進行拍攝。

1.4.2 FFA 檢查 激光光凝后即刻或在3、7、14、21 d不同觀測時間點，將靜脈麻醉狀態下的實驗兔置于造影機前，自兔耳緣靜脈快速注入10%熒光素鈉注射液（0.1 ml/kg），調整焦距和亮度，待熒光素鈉循環至眼底，以視盤和激光光凝點為中心進行熒光素鈉血管造影檢查，觀察眼底視網膜靜脈阻塞、側支循環建立以及損傷血管再通情況[3-4]。

1.5 組織病理學

造模后分別在7、14、21 和28 d 四個時間點，將實驗兔用空氣栓塞法處死，摘除眼球，10%福爾馬林溶液固定，眼球壁石蠟包埋切片，每個時間點選取臨近光凝部位的6 張切片，HE 常規染色，光學顯微鏡下觀察視網膜結構變化，同時每張切片在400 倍光學顯微鏡下隨機選取5 個不同視野，統計神經節細胞的密度及外核層細胞層數的變化情況。

1.6 統計學方法

采用SPSS19.0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間的兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 視網膜眼底觀察

激光光凝視網膜靜脈分支時，可見血流逐漸變慢至單個紅細胞通過光凝變窄處，隨后血流停止，靜脈阻塞形成；造模后在接觸鏡和檢眼鏡下均可見光凝點遠端靜脈擴張、迂曲、顏色加深，相應區域出現輕度灰白色混濁、水腫，有些兔阻塞靜脈的周圍有小片狀出血。

眼底照相：光凝血管收縮變細，血柱變窄甚至消失，光凝靜脈呈臘腸樣節段狀閉鎖，毗鄰視網膜呈灰白色水腫或見散在出血，受阻靜脈直至終末小靜脈明顯迂曲擴張，阻塞區供應動脈痙攣性收縮變細（圖1）。

圖1 實驗兔光凝后彩色眼底照相。可見光凝處靜脈血流阻斷（黑箭頭所示）遠端血管擴張，毗鄰視網膜呈灰白色水腫，周圍可見散在出血點

2.2 FFA 檢查

模型組熒光素鈉注入后約5 s 時視網膜靜脈內熒光素開始充盈，激光光凝的靜脈熒光素充盈緩慢，光凝點有熒光滲漏，遠端靜脈擴張、迂曲，近端無熒光素充盈。FFA 圖片可見造模眼出現熒光遮蔽現象，以及光凝的靜脈周圍存在多少不等的熒光素滲漏（圖2）。

不同時間點各組造模后FFA 結果示：連續觀測組中，3 d 時FFA 顯示有熒光遮蔽和滲漏現象，光凝處局部無灌注；7 d 時光凝處血管變迂曲，滲漏區縮小；14 d 時血管仍為迂曲狀，但回流開始增加，損傷部位血管有熒光素著染，遠端血管緩慢充盈；21 d 時血管完全再通，但血管仍明顯迂曲擴張；單個時間點觀測組的動物模型，3 d 與7 d 時與連續觀測組模型表現情況大致相同；14 d 時部分動物仍有靜脈充盈緩慢延后，血管迂曲變細現象，說明BRVO 模型維持穩定；21 d 時光凝血管發生再通，可見血管有迂曲變細的形態變化。因此，兩個觀測分組FFA 的比較結果顯示：兩組動物均造模成功，光凝血管阻塞程度表現大致相同，并且模型維持時間及血管再通時間也基本一致（圖2）。

圖2 FFA 檢測兔視網膜血管血流情況。2A 正常兔視網膜血管血流通常，熒光素均勻充盈；2B 造模后即時檢測光凝靜脈周圍出現熒光素滲漏；2C 造模后3 d 光凝點處有熒光素滲漏，滲漏區較前縮小；2D 造模后7d 血管迂曲變細，靜脈損傷部熒光素呈點狀滲漏；2E 造模后14d 血管仍為迂曲狀，損傷靜脈有熒光素著染；2F 造模后21 d 血管再通仍為迂曲形態，有側支循環建立

2.3 視網膜組織病理學

圖3 模型兔視網膜組織HE 染色（×400）。3A 正常兔視網膜組織各層組織排列較整齊；3B 造模后7 d 可見視網膜神經節細胞層、內叢狀層、內核及外核層水腫增厚；3C 造模后14 d 外核層細胞相對減少，剩3～4 層細胞；3D、3E 造模后21 d、28 d 視網膜基本恢復正常；3F 模型兔視網膜血管中可見血小板與紅細胞結合成的血栓組織，血管管壁完整

造模后實驗兔視網膜整體結構較紊亂，7 d 時神經節細胞層、內叢狀層嚴重水腫，內核層和外核層也有輕度水腫；14 d 時神經節細胞明顯減少，外核層相對變薄；21 d 與28 d 視網膜結構逐漸恢復正常。部分血管可見少量血栓及纖維組織（圖3）。統計各時間點實驗兔視網膜神經節細胞數量與外核層細胞層數，發現在14 d 時模型兔視網膜神經節細胞數（2.83±1.17） 明顯少于正常兔視網膜神經節細胞數（12.33±8.07）個，t=2.480，P=0.020，有統計學意義。其他時間點基本同正常組；14 d 時模型兔外核層細胞（4.00±1.27） 層少于正常對照組外核層細胞層數（5.83±0.75）層，t=4.166，P=0.000，有統計學意義（圖4），其他時間點較正常組無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 兔視網膜組織中神經節細胞數與外核層細胞層數變化。4A 視網膜神經節細胞數（RGC/個）對比圖；4B 視網膜外核層細胞層數（層）對比圖

3 討論

視網膜靜脈阻塞模型目前最常用的動物有大鼠、有色兔與白兔等，大鼠由于眼球小，視網膜血管細，造成了光凝造模的技術難度；并有報道稱光凝后SD 大鼠死亡率高，約為20%～30%，眼球局部急性反應耐受不良，可能與光凝所致的疼痛導致的心律失常有關；光凝血管再通時間約為3～5 d[3]，模型穩定性差；兔子因實驗成本低，眼球較大，視網膜動、靜脈血管利于觀察，在RVO 研究中被大多數學者選為模型動物，但兔眼的解剖結構與人類有較大差異，尤其兩側視網膜靜脈走行與人體眼不一樣為直行，并不匯聚成靜脈血管弓，動靜脈之間存在廣泛的動靜脈交叉，并且在視網膜和脈絡膜之間存在一些毛細血管，因此這些解剖學差異使我們無法創造出與人類完全一致的BRVO 模型；當前研究表明，色素含量不同的視網膜在接受光化學法造模后，實驗結果存在一定程度的差異，在眼底觀察方面，有色兔的RPE 層可見明顯的色素顆粒，故有色兔將更有利于對病程的掌握和觀察[5]。但目前使用白兔造模仍然較為普遍。

建立視網膜靜脈阻塞模型的方法有多種：光化學法、直接激光光凝法、光動力誘導法、血管結扎、冷凝、凝血酶靜脈滴注法、玻璃體內注入內皮素-1 等[6]。其中直接激光光凝法及光動力誘導法由于臨床效應和精準度問題應用減少，而外科手術及凝血酶、內皮素注射法由于造模成功率低未得到廣泛應用[7]。1987年，Nanda 等[8]首先利用氙光燈激光加孟加拉紅成功制作兔BRVO 模型，這種方法被稱為光化學法，其原理是利用激光激發光敏劑后產生的熱效應阻塞血管[9]。本實驗中將熒光素鈉作為光敏物質，它的激發光波長范圍為530～570 nm，本次實驗使用的波長530 nm 正好將其激光吸收優勢發揮到最佳。熒光素鈉注射后約有60%可與血紅蛋白結合，在造模過程中發揮了與孟加拉紅相同的功效，吸收光能后產生單態氧，可使脂質、蛋白質和細胞核酸過氧化，使細胞損傷。脂質過氧化造成血管內皮細胞損傷，激發血小板黏附和凝集，從而啟動凝血系統，導致血栓形成，因此光化學法建立的BRVO 模型，其血栓形成機制與臨床較相似[10-11]。然而，光化學法也有一定的缺點與局限性，例如臨床上激光作為BRVO 的一種常見治療方法，因此其作為造模方法并不能排除激光本身的治療作用[12]。同時由于激光的熱效應會導致光凝部位視網膜外核層的細胞損傷或凋亡，而影響實驗結果。再者，熒光素鈉等常見光敏劑極敏感，非常容易導致光凝的靜脈破裂出血，造成嚴重的玻璃體積血進而影響實驗觀察，因此，應根據實驗動物本身的耐受性與敏感性選取合適的質量濃度與注射劑量。最后，激光操作人員的激光技術和穩定性以及輔助人員的穩定性均會影響造模結果，因此，對團隊的配合和協作有較高要求。總之，與以上其它方法相比，光化學法具有造模方法簡單，可批量制作，模型重復性好，成功率高，損傷精確可視化等優點，并且光化學法建立的RVO 模型，其血栓形成機制與臨床更相似，所以光化學法用于建立BRVO 模型被廣泛認可。隨著激光技術的進步與光敏制劑研究的深入，光化學法造模操作技術不斷改進，文獻中成功的新西蘭白兔RVO 模型的技術參數：光敏劑多選用孟加拉紅和熒光素鈉；倍頻532 型激光機，采用二極管激發式固態激光，波長為532 nm，能量設定為100～130 mW，光斑直徑對應75 μm，持續時間0.2 s，照射點為10～18點[11]；還有能量設定為400 mW，光斑直徑為100 μm，持續時間為0.2 s，光凝點數為30 點[13]；倍頻ND：YAG激光機，采用氪-綠激光，波長為530 nm，能量設定為300 mW，光斑直徑為100 μm，持續時間0.2 s，光凝點數為60 點[4]等。不同的激光類型，具體參數也不同，需要在實驗中調整，但結果均顯示造模成功。

關于光化學法制備BRVO 動物模型的報道很多，但一直以來沒有標準的造模參數，本實驗成功建立了視網膜分支靜脈阻塞的模型，現將該模型的優缺點總結如下，優點是，（1）實驗動物的選擇：新西蘭白兔成本較低，眼球較大，可在眼底鏡下直接動態觀察視網膜微循環的確切變化。雖然兔眼視網膜血管走行于視網膜有髓神經纖維中，但不影響實驗觀察和操作[14]。（2）光凝血管大小和位置的選擇：選擇兩側視網膜靜脈距離視盤0.5 DD 的分支靜脈處，此處血管清晰且粗細得當，根據實驗兔個體解剖結構差異，光凝1～2 根分支靜脈，既保證了光凝過程中穩定性問題，同時又能保證造模成功率。（3）光凝方法和光凝點數量的選擇：采用節段性光凝，先光凝選定部位的兩端，見靜脈收縮后再光凝中央，最終形成一段約1/3 DD 的靜脈阻塞區域，既避免光凝單點位置造成血管破裂出血，以及易損傷血管周圍視網膜等問題，又能通過增大血管阻塞部位及程度，有效地延長模型維持時間，提高造模成功率。（4）動物分組：本實驗動物分為連續觀測組與單個時間點觀測組，得出的結果更豐富，減少了動物個體差異的影響；同時能進行不同時間點的病理學研究。從觀察結果看，14 d為本實驗的時間節點暨最可靠的靜脈血管阻塞維持時間點，為后期研究提供了基礎。（5）光敏劑的選擇：熒光素鈉與孟加拉紅相比，其不與組織牢固結合，不參與機體代謝，大部分經腎臟隨尿液排出，毒性小，更安全[15]；同時可減少實驗兔耳緣靜脈炎的發生。（6）臨床符合性：臨床中視網膜分支靜脈阻塞患者多合并高血壓病、糖尿病、高脂血癥等疾病，并且這些疾病本身作為BRVO 的危險因素，參與了其發病過程，因此建立合并相關疾病的光化學兔BRVO 模型，更能接近臨床實踐。實驗中的問題與不足：（1）由于白兔眼底視盤界限模糊，顏色較暗，眼底彩照無法拍攝滿意的效果，今后應注意選用適合實驗動物眼底彩照的專業儀器；（2）由于預實驗中單純激光光凝血管再通快，模型難以維持，故優化造模方法加用熒光素鈉光敏劑，在后期實驗中可設置激光光凝組作為對照以使實驗設計更完整；（3） 目前的BRVO 模型還不能完全模擬人類視網膜靜脈阻塞的發病機制及病理改變，研究者應根據研究目的選擇不同的BRVO 模型才能保證研究的科學性[16]。

綜上所述，通過選擇合適的實驗動物，恰當的激光類型、能量和光凝時間，合理的光凝位置，比較適宜的光敏劑等，可以成功模擬BRVO 的臨床病理過程，成功建立新西蘭兔BRVO 模型，該造模方法切實可行、重復性好、成功率高。可依據實驗目的改進細節以期模擬出更長期穩定、更符合臨床實際的BRVO 模型。