顳下頜關節骨關節病關節液的定量蛋白質組學研究

胡靜 鐘曉波 朱士勝

摘要：目的? 鑒定顳下頜關節骨關節病（TMJOA）患者關節液中蛋白質表達情況，篩選出生物標志物，并初步探討其發病機制。方法? 選擇2019年5～10月22例于我院行顳下頜關節玻璃酸鈉注射治療的TMJOA患者作為實驗組，收集同期10名健康志愿者作為健康對照組，采集兩組受試者關節液標本，應用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）-LC-MS/MS檢測和鑒定差異蛋白，對差異表達的蛋白進行生物信息學分析。結果? 共鑒定出蛋白370個，與健康對照組相比，實驗組中差異表達蛋白82個，其中上調蛋白35個，下調蛋白47個（差異倍數≥1.5 或≤0.67，P≤0.05）。差異蛋白主要參與的生物學過程有：cellular process，metabolic process，biological regulation，response to stimulus等;主要涉及的分子功能包括：binding，catalytic activity，enzyme regulator activity等;差異蛋白主要富集在PPAR signaling pathway通路。結論? iTRAQ-LC-MS/MS技術成功篩選到多個與TMJOA發病相關的蛋白，C4BPA、CD5L、PRDX2、CAH1可作為TMJOA診斷的候選生物標志物和潛在治療靶點。

關鍵詞：顳下頜關節骨關節病;關節液;蛋白質組學;同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）;生物標志物

Abstract：Objective? To identify the protein expression in the joint fluid of patients with temporomandibular joint osteoarthropathy （TMJOA）， screen out biomarkers， and initially explore the pathogenesis.Methods? Between May 2019 to October 2019， 22 TMJOA patients treated with sodium hyaluronate injection in our hospital were selected as the experimental group， and 10 healthy volunteers were collected as the healthy control group during the same period. The synovial fluid specimens were detected and identified by differential isotope labeling relative and absolute quantification （iTRAQ） -LC-MS/MS， and differentially expressed proteins were bioinformatically analyzed.Results? A total of 370 proteins were identified.Compared with the healthy control group， there were 82 differentially expressed proteins in the experimental group， including 35 up-regulated proteins and 47 down-regulated proteins （fold≥1.5 or ≤0.67， P≤0.05）. Differential proteins are mainly involved in cellular process，metabolic process，biological regulation，response to stimulus， etc.; the main molecular functions involved include： binding，catalytic activity，enzyme regulator activity， etc.; differential proteins are mainly rich set in PPAR signaling pathway.Conclusion? iTRAQ-LC-MS / MS technology successfully screened multiple proteins related to TMJOA pathogenesis. C4BPA， CD5L， PRDX2， and CAH1 can be used as biomarkers and potential therapeutic targets for TMJOA diagnosis.

Key words：Temporomandibular joint osteoarthropathy;Jointfluid;Proteomics;isotope labeling relative and absolute quantification （iTRAQ）;Biomarkers

顳下頜關節骨關節病（temporomandibular joint osteoarthropathy，TMJOA）是發生在關節軟骨和關節下骨的非炎癥性退行性疾病，以進行性關節軟骨喪失為主，伴有軟骨修復和軟骨下骨重塑或硬化為主要病理表現[1]。青少年及以上年齡段人群均可發病，發病率隨年齡增大而升高[2]。主要臨床表現為關節區捻發音或破碎音，可有開口受限或下頜運動障礙，當出現關節區疼痛癥狀時，定義為顳下頜關節骨關節炎[3]。另外可伴隨著頭痛、耳部癥狀、頸部癥狀以及全身癥狀，嚴重影響患者的生活質量。目前其病因不明，臨床診斷主要依靠病史、臨床表現及影像學檢查，缺乏實驗室診斷方法[4]。蛋白質組學可闡明生物體全部蛋白質的表達模式及功能模式，已廣泛用于腫瘤、心血管、神經系統等疾病狀態下的特異表達蛋白的鑒定，疾病標志物篩選、發病機制研究、新藥開發等[5]。因此，蛋白質組學可能為TMJOA的診斷及病因探討帶來新突破。2004年美國應用生物系統公司（ABI）開發的多肽體外同位素標記相對和絕對定量技術（iTRAQ）可同時對多達8種樣品進行絕對和相對定量研究[6]。其對低豐度蛋白檢測的靈敏度高，分離能力強，可定性定量同步進行，與質譜技術聯用，可高效篩選出差異表達蛋白。目前，基于該技術的蛋白質組學已經在膝關節等大關節疾病的標志物篩選和機制探討研究中廣泛開展[7，8]。為此，本研究通過iTRAQ技術對顳下頜關節液進行檢測，旨在探索該病患者關節液中的差異表達蛋白，并結合生物信息學技術分析，篩選出該疾病的潛在生物學標志物，并從分子學水平探討其可能發病機制。

1資料與方法

1.1一般資料? 于2019年5～10月選擇重慶醫科大學附屬口腔醫院22例行顳下頜關節玻璃酸鈉注射治療的TMJOA患者作為實驗組，其中男2例，女20例，均符合Schiffman E等[9]的診斷標準。另外收集同期10名健康志愿者作為健康對照組，其中男1名，女9名。本研究經本單位人體試驗倫理委員會的審查批準[2019年倫審（63）號]并符合2013版赫爾辛基宣言，已取得患者及其家屬的知情同意并簽署知情同意書。

1.2納入及排除標準? 納入標準：①可有關節彈響史及間斷性關節絞索史;②關節捻發音;③可有開口型異常或開口受限;④關節區無明顯疼痛;⑤CBCT顯示存在關節病變：髁突骨皮質模糊或不連續，骨質小凹陷缺損和破壞，包括松質骨在內的硬化性骨質增生、囊樣變、骨質破損或磨短扁平，骨贅形成。排除標準：①MJ外傷史、感染史、腫瘤等顳下頜關節疾患者;②患有甲狀腺和甲狀旁腺功能亢進、肝腎疾病、糖尿病等影響骨代謝疾病;③近1年接受過顳下頜關節腔內注射藥物及其他治療者;④有嚴重的系統性疾病者;⑤孕婦及哺乳期婦女;⑥有中、重張口受限者;⑦有明顯的精神或心理問題者;⑧資料不全者。

1.3方法

1.3.1標本采集? 受試者取半仰臥位于45°牙科治療椅上，常規皮膚消毒鋪巾，囑其大張口，穿刺點為耳屏中點至外眥連線上、耳屏前1 cm處，用5號注射器向前上內刺入顳下頜關節間隙水平面，抵關節結節后斜面，刺入關節腔，回抽無血后注射2%利多卡因1.5 ml，反復灌洗5次后抽盡液體，再注入透明質酸鈉（施沛特）1 ml。注射完畢后，囑患者緊密咬合，用消毒紗布壓迫針刺點2～3 min，避免局部出血。健康志愿者無注射透明質酸鈉步驟。采集的關節液低溫保存下盡快送往實驗室，離心（4 ℃，2000 r/min，10 min），分裝到EP管，-80 ℃保存。

1.3.2蛋白質定量? Bradford法測定蛋白濃度，根據標準曲線和蛋白樣品稀釋倍數計算出蛋白樣品的濃度。

1.3.3 iTRAQ聯合液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）鑒定? 取兩組適量樣品進行蛋白質提取。用100 mmol/L TEAB將蛋白溶液稀釋5倍，按1：50的質量比例（胰酶：蛋白）加入胰蛋白酶，37 ℃酶解過夜。酶解后的肽段用C18柱脫鹽。iTRAQ-8標試劑盒（SCIEX）對各肽段進行標記（N：114，OA：115），并均勻混合。將混合后的肽段運用Ultimate 3000 HPLC系統（Thermo DINOEX，USA）對肽段樣品進行分級分離。色譜柱使用的是Durashell C18柱（5 μm，100? ，4.6×250 mm）。利用堿性條件下逐漸升高的ACN濃度實現肽段的分離，流速為1 ml/min，每分鐘收集1管。將標記后的多肽樣品加到C18捕獲柱（5 μm，100 μm×20 mm）上，并以90 min時間梯度，300 nl/min的流速在C18分析柱（3 μm，75 μm×150 mm）上用緩沖液A（2%乙腈/0.1%甲酸/ 98%H2O）和緩沖液B（98%乙腈/0.1%甲酸/2% H2O）進行梯度洗脫。使用TripleTOF 5600plus質譜儀檢測肽段信號，以250 ms的離子累積時間進行一級質譜圖的掃描，并以50 ms的離子累積時間采集30個前體離子的二級質譜圖。在350～1500 m/z的范圍內采集MS1光譜，并在100～1500 m/z的范圍內采集MS2光譜。將前體離子動態排除時間設置為15 s。

1.3.4數據分析? 對于鑒定到的肽段，設置可信度水平在95%以上。僅保留至少包含一個唯一肽段且可信的肽段進行蛋白質定量。當差異倍數≥1.5或≤0.67，且經過顯著性統計檢驗其P值≤0.05時，認為該蛋白存在表達差異。應用DAVID富集分析平臺對初步鑒定的差異表達蛋白功能富集分析，選擇G0分析生物過程、細胞組分和分子功能注釋對差異蛋白分類，選擇KEGG通路數據庫對差異蛋白所涉及的代謝通路進行分析。通過STRING數據庫以及Cytoscape3.6.1軟件進行蛋白質-蛋白質互作（PPI）網絡分析。

1.4統計學方法? 差異蛋白的P值計算采用Proteinpilot軟件內置算法獲得的，由與蛋白質匹配的所有譜圖的差異倍數經過單樣本Student's t檢驗獲得的。最后根據差異倍數和Pvalue來篩選顯著差異蛋白。當差異倍數達到1.5倍及以上（即up_regulate≥1.5和down_regulate≤0.67），且經過顯著性統計檢驗其P≤0.05時，視為顯著差異蛋白。

2結果

2.1總蛋白質定量信息? 從定量信息結果來看，關節液樣本蛋白總量滿足上機標準，兩組蛋白濃度見表1。

2.2兩組差異表達蛋白? 共鑒定出370種蛋白，共鑒定出蛋白370個，與健康對照組相比，實驗組中差異表達蛋白82個，其中上調蛋白35個，下調蛋白47個（差異倍數≥1.5 或≤0.67，P≤0.05），差異蛋白的火山圖見圖1。其中排名上、下調前10的差異蛋白見表2。

2.3生物信息學分析? GO注釋結果顯示，差異蛋白主要參與的生物學過程包括cellular process，metabolic process，biological regulation，response to stimulus等。主要涉及的分子功能包括binding，catalytic activity，enzyme regulator activity等，且這些差異蛋白大多數屬于extracellular region part成分。見圖2。KEGG信號富集分析顯示，前20條通路中PPAR signaling pathway通路的富集程度最高，而complement and coagulation cascades通路中包含差異表達蛋白數量最多（13個），其次為systemic lupus erythematosus通路（10個），見圖3。

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編輯/成森