辣椒脈斑駁病毒湖南分離物全基因組序列測定及分子特征

譚汝晴 羅香文 卜姍 張宇 張松柏 張德詠 劉勇

摘要：[目的]辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle VlFl3S，ChiVMV）是東南亞茄科作物主產地主要病毒種類之一，嚴重危害辣椒等茄科作物的生產。測定ChiVMV的全基因組序列，分析其分子特征，可以明確該病毒的適應性進化以及對我國辣椒等茄科作物的潛在威脅提供科學基礎。[方法]以湖南疑似感染ChiVMV辣椒為樣本，采用smallRNA高通量測序結合RT-PCR測定病毒全基因組序列，利用Mega、RDP及DnaSP等生物學軟件分析其分子特征。[結果]ChiVMV湖南分離物全長基因組序列為9704nt（不包含3'-A尾），與其他分離物的序列同源性為84%～94%。系統發育分析表明，我國的ChiVMV聚類為一個亞簇，與其他國家和地區分離物不存在重組事件。基因的替換指數R=3.29，替換堿基類型主要是C/T替換。[結論]堿基替換突變可能是ChiVMV湖南分離物適應性進化的主要因素。

關鍵詞：辣椒脈斑駁病毒;全基因組序列;系統發育分析;RNA突變和重組

中圖分類號：S 436.418.1+2文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）02018705

0 引言

（研究意義）辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinalmottle virus，ChiVMV），屬馬鈴薯Y病毒科（Potyvi-ridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），是茄科作物的主要病毒種類之一，嚴重危害茄科作物的生產。ChiVMV傳播擴散過程中，在作物品種、環境等選擇壓力下，其基因組發生突變、重組等適應性進化，分析ChiVMV的全基因組序列，可以為分析ChiVMV的適應性進化分子機制提供科學依據。（前人研究進展）ChiVMV在馬來西亞西部的辣椒上首次報道，現已擴展到東南亞多國，成為這些地區辣椒等茄科主要作物減產的主要原因之一。此外，在非洲的部分地區，也發現該病毒危害。目前，該病毒在我國多個地區有發生危害的報道。2003年，我國陜西辣椒上發現該病毒侵染;隨后該病毒快速擴展至我國多個省份辣椒主產區，2016年湖南和福建兩省的辣椒上ChiVMV檢出率分別達到35%和20%。2017年報道的侵染貴州辣椒的ChiVMV株系，其親緣關系與四川和云南株系親緣關系最近。而廣東辣椒ChiVMV株系與海南分離物的親緣關系最近。這些研究表明，ChiVMV在我國呈現快速擴展的態勢，且其基因組序列存在一定的遺傳變異。（本研究切入點）雖然我國有少數幾個ChiVMV分離物全基因組序列被測定，還有一些CP基因或基因片段被測定;但是ChiVMV分離物的分子特征、遺傳進化等報道較少，ChiVMV在我國傳播擴散、適應性進化的分子機制，目前尚不明確。（擬解決的關鍵問題）本研究在報道湖南和福建辣椒上ChiVMV發生的基礎上，選擇侵染湖南辣椒的ChiVMV分離物，測定其全基因組序列，分析其分子特征及其遺傳進化，研究結果可為明確該病毒的適應性進化機制以及分析其對我國辣椒等茄科作物的潛在威脅提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

辣椒樣本于2014年采自湖南省長沙市高橋鎮，種植于湖南省植物保護研究所溫室內。辣椒樣本的癥狀為：葉片黃化、畸形，植株略矮縮。辣椒葉片樣本經RT-PCR檢測ChiVMV侵染。辣椒葉片樣本采用液氮速凍，保存于-80℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA抽提、小RNA高通量測序及數據分析

總RNA抽提采用Trizol法（生工生物工程有限公司，上海），0.1g辣椒葉片，采用液氮研磨，加入Trizol試劑，離心取上清，加氯仿混勻，離心后加乙醇沉淀RNA，加入DEPC處理H20溶解總RNa.小RNA（sRNA）庫采用Small RNA v1.5Sample Prep試劑盒（Illumina，USA）構建，具體步驟參考說明書，sRNA測序采用Solexa測序儀（Illumina，USA）。sRNA數據分析采用Illumina GA P1peline v1.3software，高質量的sRNA數據（18-30nt）采用軟件Velvetl.0.5拼接成長片段。拼接后的長片段序列在GenBank的病毒數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesHome.cgi？）進行nblast比對。

1.2.2RT-PCR 根據sRNA高通量測序獲得ChiVMV基因組序列片段，設計RT-PCR引物，引物序列見表1.RT-PCR參考文獻。PCR產物純化后連接到pEASY-T5載體（全式金，北京），序列委托生工生物技術有限公司測定。ChiVMV基因組全序列采用DNAMAN，version 8（Lynnon，Quebec，Canada）組裝。

1.2.3序列遺傳進化分析 ChiVMV CP基因或全基因組序列的系統發育分析，采用CLUSTAL w進行多序列聯配，采用MEGA 5.0構建Maximum-likelihood系統發育樹。序列重組分析采用RDP4軟件，采用算法Recombination Detection Program（RDP），GENE-CONV，BOOTSCAN，MaxChi，CHIMAERA和SISCAN分析序列的重組事件。序列突變分析采用軟件DnaSP（version 5）。

2結果與分析

2.1 ChiVMV湖南分離物全基因組序列特征

sRNA高通量測序結果表明，sRNA高通量測序共計獲得10.25Mb序列（18-29nt），經過序列拼接，獲得2563個長片段（contigs）（45-852nt）。nblast比對結果表明，37個contigs比對到ChiVMV基因組（NC 005778.1），覆蓋約80%的ChiVMV全基因組。剩余20%序列由常規RT-PCR補齊。ChiVMV湖南分離物的全基因組序列為9704nt（不包含3'A尾）。該基因組序列在ENA（European NucleotideArchive）browser（http：//www.ebi.ac.uk/ena/data/view/LN832362）登錄號為LN832362.

2.2ChiVMV序列系統發育分析

ChiVMV湖南分離物的全基因組序列系統發育分析表明，湖南分離物與韓國的2個分離物聚為1個亞簇，親緣關系最近（圖1）。GenBank中收錄的ChiVMV的CP基因比其全基因組序列更多，因此，基于CP基因序列水平，分析了ChiVMV分離物的系統發育，結果（圖2）表明，ChiVMV湖南分離物與印度分離物聚為1個亞簇。

2.3ChiVMV序列重組分析

ChiVMV全基因組序列重組分析（圖3）表明，我國的ChiVMV分離物Yp8和印度分離物Ch-War有2個重組事件，Yp8分離物與印度分離物J0和Ch-jal各有1個重組事件;而ChiVMV湖南分離物與其他分離物沒有重組事件。

2.4ChiVMV序列突變分析

采用DnaSP軟件分析了ChiVMV分離物全基因組水平的基因突變，結果表明（表2），ChiVMV分離物之間的總體堿基替換突變偏差為R=3.29，且主要是C/T替換為主。在ChiVMV基因組序列中，總共有1249個核苷酸多態性位點，約占ChiVMV基因組序列的12.9%。

3 討論與結論

植物病毒在與寄主/傳毒介體以及環境的互作中，在選擇壓力下，其基因組序列會發生變異，從而產生適應性進化，快速擴展危害。ChiVMV全基因組序列分析結果表明，我國不同地區的分離物存在一定的分子變異，如貴州分離物與四川和云南分離物同源性高;而廣東分離物與海南分離物親緣關系近。本研究測定的ChiVMV湖南分離物，與其他分離物的同源性為84%～94%，與韓國分離物和印度的親緣關系最近，表明ChiVMV在我國的不同地區存在不同的遺傳變異。馬鈴薯Y病毒屬可以摩擦接種，部分病毒通過傳毒介體傳播，此外，還有部分病毒可以種傳，ChiVMV也可以種傳，ChiVMV湖南分離物與韓國、印度分離物親緣關系近，可能是由于湖南種植的品種，其親本來源于韓國或印度的辣椒資源，通過種子方式引進。因此，急需開展更多ChiVMV分離物基因組序列測定，明確ChiVMV在我國的遺傳變異情況，為分析該病毒的潛在威脅提供依據，也為抗性育種提供理論參考。

序列重組和突變，是植物病毒適應性遺傳變異的2種最重要的方式;ChiVMV等正鏈RNA植物病毒，為適應不同品種、環境的選擇壓力，可通過重組和突變，顯著改變其基因組序列，從而改變其病毒群體。ChiVMV分離物的重組和突變分析，目前報道較少。本試驗研究表明，我國ChiVMV其他地區的分離物與韓國和印度分離物之間存在重組事件，表明重組在ChiVMV分離物遺傳變異中發揮重要作用;然而，ChiVMV湖南分離物的遺傳變異，可能與我國其他地區分離物不同，該分離物與其他ChiVMV分離物之間沒有重組;進一步的分析表明，突變可能是ChiVMV湖南分離物遺傳變異的主要原因。與植物DNA病毒相比，植物RNA病毒的基因組更易發生突變，從而適應寄主等選擇壓力。本研究結果表明，序列重組和突變在我國ChiVMV不同地區分離物的遺傳變異中發揮不同的作用。

辣椒種植效益高，目前在我國廣泛種植。鑒于ChiVMV在我國快速擴展，且其基因組遺傳變異快，認為急需加強ChiVMV的監測，測定更多地區ChiVMV分離物的基因組序列，分析其遺傳變異，為分析該病毒對辣椒等茄科作物的潛在威脅提供科學依據，也為抗性育種提供理論參考。