竹屑制備天然防腐劑的工藝優化及抑菌性能研究

胡永樂 張傳海 張媛 尤永芳 黃薇 賈小麗

摘要：[目的]為研究竹屑制備天然防腐劑的最優工藝并探討其抑菌性能。[方法]以竹屑為原料，采用乙酸乙酯回流法，在單因素試驗基礎上，應用響應面法優化天然防腐劑制備條件，并考察其抑菌活性。[結果]竹屑制備天然防腐劑的最佳工藝條件為超聲功率300W、提取溫度89℃、液料比20：1、提取時間2h.在此條件下，所得提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉的抑菌效果達到最強，抑菌圈直徑分別為：9.33、15.67、10.00、6.67mm，最低抑菌濃度分別為：0.02500、0.01250、0.05000和0.10000g·mL^-1，竹屑天然防腐劑得率為4.77%。[結論]響應面法優化工藝制備的天然防腐劑對4種供試菌抑菌效果良好，制備工藝可行性高。該工藝可為竹廢棄物的加工再利用提供參考。

關鍵詞：竹屑;天然防腐劑;響應面分析法;工藝優化;抑菌

中圖分類號：7S202.3文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（1020）02-0226-9

0 引言

（研究意義）中國竹種類豐富多樣，竹林面積、蓄積量和產量均居世界之首。第八次全國資源連續清查報告表明，我國竹林面積已達601萬hm²，是重要的森林資源之一。材用竹廣泛應用于建筑、家具、造紙和工藝品等行業，在竹加工產業中，產生的廢棄物約占整個竹產品的60%以上，這些“廢料”的丟棄導致竹材的利用率始終停留在35%～40%這一階段。（前人研究進展）相關研究表明，毛竹采伐剩余物主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，經硫酸鹽法成漿后，紙漿得率為44.71%。目前竹屑的資源化利用形式主要有直接利用、傳統加工利用和工業化利用，產品主要包括復合材料、生物質燃料、活性炭、食用菌基質和多糖等。此外，竹屑中還含有蛋白質、脂肪、糖、礦物質和多種次生代謝產物，含量因竹種、竹部位、采伐季節以及生長環境而異。從植物的次生代謝產物中獲取天然的抗菌成分，一直是國內外天然防腐劑的研究熱點。（本研究切入點）天然植物源防腐劑提取工藝復雜、成本高、生產季節性強，是影響其獲取和廣泛應用的限制性因素。竹屑為竹產業加工的廢棄物，且資源豐富，以竹屑為原料制備天然防腐劑應用于抗菌領域的研究鮮見報道。（擬解決的關鍵問題）以竹屑為原料，采用簡便、可行性高的乙酸乙酯回流法制備天然植物源防腐劑，通過響應面法優化提取工藝，并考察其對食品中常見有害微生物的抑制作用。期望本研究結果能為低毒天然植物源防腐劑的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料與設備

將竹廢棄物收集于武夷山竹加工廠，用高速中藥粉碎機粉碎，過60目篩，制成竹屑，備用;大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、黑曲霉（Aspergillus niger），均為武夷學院生物工程實驗室保藏菌種;乙酸乙酯、硝酸鈉和磷酸氫二鉀等分析純試劑，瓊脂粉、牛肉膏和蛋白胨等生化試劑，均購自上海麥克林生化科技有限公司。

103B型高速中藥粉碎機（永歷制藥機械有限公司）;BSA 223S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）;R206D旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）;LG-1002-A型超凈工作臺（蘇州真田潔凈設備有限公司）;生化培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）;KQ-500D型數控超聲波清洗器（瑞利儀器分析有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1竹屑制備天然防腐劑的單因素試驗 稱取5.0g竹屑，在液料比為20：1（mL：g）的乙酸乙酯溶液，超聲功率分別為100w、200w、300w、400W的條件下超聲1h，于90℃的熱水浴中進行2h的回流提取，提取2次。將提取液合并后，在旋轉蒸發儀上減壓濃縮至黏稠狀，將濃縮提取液在真空干燥箱中干燥成粉末后進行稱重。分別測定不同功率超聲波處理下所得提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉的抑菌效果，計算得率（得率/%=提取所得天然防腐劑干重/竹屑質量×100）。將優選的最佳超聲功率作為固定參數，依次進行提取時間（1h、2h、3h、4h、5h），液料比（10：1、15：1、20：1、25：1、30：1），提取溫度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）對制備產物抑菌效果的單因素試驗。試驗均重復3次，取平均值。

1.2.2響應面法優化竹屑制備天然防腐劑工藝試驗在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，在固定功率300w超聲1h、提取2次的基礎上，選取提取溫度、液料比、提取時間3個因素，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉為指示菌，抑菌圈直徑為響應值，對試驗結果進行分析。試驗因素及水平見表1.

1.2.3 防腐劑抑菌效果的試驗與評價 菌懸液的制備：在無菌條件下用劃線法分別將保藏的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉菌種接種于相應的固體斜面培養基上，放人培養箱中，細菌在37℃下培養24h、霉菌在28℃下培養48h進行活化。挑取活化好的菌落，用無菌生理鹽水lo倍稀釋法制得不同稀釋濃度的菌懸液，菌落計數調整菌濃度為1×10⁶～1×10⁷CFU·mL^-1，備用。

抑菌圈直徑的測定：取配制好的菌懸液各100uL，均勻涂布在相應的無菌平板培養基上。將已滅菌烘干、直徑為6.0mm的圓濾紙片放人1g·mL^-1竹屑天然防腐劑溶液中浸泡30min，取出后貼在含菌平板上，以無菌生理鹽水作為空白對照。含大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的平板在37℃恒溫培養24h，含黑曲霉的平板在28℃恒溫培養48h，之后取出測量抑菌圈直徑大小，每個抑菌圈在垂直方向上測兩次，每個試驗重復3次，取其平均值。抑菌圈直徑越大，則抑菌效果越好。