N-myc下游調控基因家族在肝細胞癌中的診斷及預后價值

羅 瓊， 王春明， 廖航宇， 陳錕靈， 潘明新

1 南方醫科大學附屬衡陽醫院(衡陽市中心醫院) 普通外科， 湖南 衡陽 421000；2 南方醫科大學珠江醫院 肝膽二科， 廣州 510282

肝癌是全球癌癥死亡的第二大主要原因[1]，僅中國就占病例總數和死亡總數的50%[2]。目前，肝癌尚無合適的預后指標，找到合適的預后指標有利于改善預后和個體化治療。N-myc下游調控基因(N-myc downstream regulated gene,NDRG)家族由4個成員組成：NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4。分子功能涵蓋了廣泛的生物學過程，包括細胞發育和分化，應激反應和增殖，腫瘤進展和轉移[3-4]。NDRG家族與肝細胞癌(HCC)的臨床病理特征及其預后之間的關系已有部分報道[5-7]，但結論仍存在爭議。因此，本研究通過大數據資料分析了NDRG家族在HCC中的診斷和預后價值。

1 資料和方法

1.1 數據庫及網頁分析工具 ONCOMINE平臺[8]是在線癌癥數據庫。利用ONCOMINE平臺分析NDRG家族在不同癌癥的表達譜，并利用Chen Liver和Wurmbach Liver的測序數據，比較這兩個測序數據中HCC標本中NDRG家族的mRNA表達與正常對照中的mRNA表達差異。

GEPIA[9]是基于TCGA和GTEx數據的在線分析工具。利用GEPIA分析TCGA數據庫中HCC組織和正常肝組織中的NDRG家族的mRNA表達差異，以及HCC不同病理分期中的mRNA表達差異。本研究共收集TCGA數據庫中419例HCC組織的基因表達數據分析NDRG家族表達差異，將其分為肝癌組(n=369)和正常肝組織組(n=50)。

Kaplan-Meier Plotter[10]是一個基于GEO、EGA和TCGA數據庫的生存分析工具，包含HCC患者的基因表達數據和生存信息。利用該網頁生存分析工具分析HCC患者的總生存期(overall survival，OS)，無進展生存期(progression-free survival，PFS)。本研究共收集GEO數據庫中364例HCC組織的NDRG家族基因表達數據，分為低表達組[NDRG1(212例)、NDRG2(185例)、NDRG3(182例)、NDRG4(184例)]和高表達組[NDRG1(152例)、NDRG2(179例)、NDRG3(182例)、NDRG4(180例)]。

1.2 統計學方法 采用GraphPad Prism8.2.1進行統計分析。計量資料兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步比較采用Dunnett-t檢驗采用；生存分析采用log-rank(Mantel-Cox)檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC患者NDRG家族的轉錄水平 利用ONCOMINE數據庫比較不同類型癌組織與正常組織中的NDRG家族的轉錄水平(圖1)。對Chen Liver的數據集中197個標本進行測序發現，與正常肝組織相比，HCC中的NDRG1和NDRG3過表達(P值均<0.05)，但NDRG4在HCC組織中的表達低于正常肝組織(P=0.657)(表1)。

對Wurmbach Liver數據集75個標本進行測序發現，與正常肝組織相比，HCC中NDRG2低表達(P=1.000)(表1)。因差異倍數log2FC<2，進一步進行亞組分析。從GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE6764)中檢索Wurmbach Liver的測序數據，分析NDRG2在HCC不同病理分期的轉錄水平，各分期分別與正常肝組織比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)(圖2)。

表1 NDRG家族在ChenLiver、Wurmbach數據集HCC組織與正常組織中mRNA轉錄水平差異

圖2WurmbachLiver測序數據中HCC不同臨床分期NDRG2mRNA轉錄水平的差異

2.2 NDRG家族mRNA水平與HCC臨床病理特征的關系 利用TCGA數據中的GEPIA工具比較HCC組織和正常肝組織之間NDRG家族的表達水平，結果顯示，HCC組織中NDRG1/3的表達水平高于正常肝組織，而NDRG2在HCC組織中的表達水平低于正常肝組織(P值均<0.05)(圖3a)。 不同病理分期NDRG1/2/3/4表達差異組間比較差異均有統計學意義(NDRG1:F=3.67,P<0.05;NDRG2:F=2.97,P<0.05;NDRG3:F=5.51,P<0.05;NDRG4:F=3.56,P<0.05)(圖3b)。

2.3 生存分析 使用Kaplan-Meier生存分析工具分析TCGA數據庫中的364例HCC患者NDRG家族的表達水平對生存影響的差異，結果顯示，NDRG1/3高轉錄組與低轉錄組相比，OS和PFS均顯著縮短(P值均<0.05)。NDRG1高轉錄組中位OS 37.8個月，中位PFS為13.33個月；低轉錄組中位OS為70.5個月，中位PFS為29.17個月。NDRG3高轉錄組中位OS為38.3個月，中位PFS為13.27；低轉錄組中位OS為71個月，中位PFS為29.77個月。NDRG2低轉錄組與高轉錄組相比，OS和PFS均顯著縮短(P值均<0.05)。NDRG2高轉錄組中位OS為81.9個月，中位PFS為29.73個月；低轉錄組中位OS為38.3個月，中位PFS為13.27個月。NDRG4高低轉錄組間OS無明顯差異(P>0.05)，高轉錄組與低轉錄組相比PFS顯著延長(P<0.05)。高轉錄組中位PFS為29.3個月，低轉錄組PFS為13.03個月(圖4)。

注：a，NDRG家族在HCC與正常組織中mRNA轉錄水平差異(T，肝癌組；N，正常肝組織組)；b，NDRG家族在HCC不同病理分期中的mRNA轉錄水平差異(StageⅠ:癌細胞高分化;StageⅡ/Ⅲ:癌細胞中度分化;StageⅣ:癌細胞低度分化)。

圖3NDRG家族mRNA在不同組織中的轉錄水平(GEPIA)

3 討論

NDRG家族基因的失調在許多癌癥中都有報道。盡管已經部分證實了NDRG基因在幾種癌癥的發生和預后中的作用，但尚未對HCC進一步開展生物信息學分析。本研究首次探討了HCC中NDRG家族的表達對其預后的影響，以期利用大數據基因信息資料提高對HCC患者預后判斷的準確性，或為其治療提供潛在的新靶點。

NDRG1被證實為人類乳腺癌[13-14]、前列腺癌[15]和結腸直腸癌[16]中的抑制基因。關于NDRG1在HCC中的功能存在很多爭議。Song等[17]證實NDRG1通過在轉錄水平上調節ITGB3表達來抑制HCC的增殖和轉移。Luo等[5]證實NDRG1是促癌基因。在本研究中，通過分析已有的測序數據發現，NDRG1在HCC組織中的表達高于正常組織，并且與HCC患者的腫瘤病理分期顯著相關。這一發現與認為NDRG是促癌基因的結論是一致的。生存分析發現，NDRG1的高表達與OS和PFS顯著相關，NDRG1高表達組預后更差。

NDRG2在多種人類癌細胞中有異常表達，包括前列腺癌、甲狀腺癌、結直腸癌、食道鱗狀細胞癌和膽囊癌[18-22]。既往研究[23-24]發現，NDRG2調節膀胱癌中的細胞增殖和侵襲。Wang等[25]證實NDRG2在HCC組織中顯著下調，其表達水平與腫瘤分期相關。一項回顧性研究[26]發現，NDRG2和CD24的聯合異常表達與HCC患者的無病生存期(disease-free survival，DFS)和OS相關。本研究發現NDRG2在HCC組織中顯著下調，不同病理分期組間比較其表達差異有統計學意義。盡管在Wurmbach Liver測序數據中NDRG2在癌組織與正常組織的表達差異倍數<2，但進一步亞組分析發現不同病理分期的NDRG2表達差異顯著。同時，生存分析提示NDRG2的低表達組的OS和PFS更差，表明NDRG2是HCC的抑癌基因。

NDRG3在細胞增殖、分化和其他生物學功能中起重要作用[27]。NDRG3的過表達被認為與非小細胞肺癌、前列腺癌和喉鱗狀細胞癌相關[28-30]。Fan等[31]研究提示，miR-122通過靶向NDRG3在HBV相關HCC的發生中起重要作用，認為miR-122和NDRG3可作為HBV相關HCC的診斷標志物和潛在治療靶標。一項回顧性研究[32]結果顯示，NDRG3表達是HCC患者DFS和OS的獨立預后指標。在本研究中，NDRG3在HCC組織中的表達高于正常組織。不同病理分期組間比較其表達差異有統計學意義。NDRG3高表達組患者的OS、PFS更差。

目前，對NDRG4的研究相對較少。 NDRG4參與調節人類癌癥中的細胞增殖、侵襲、遷移和血管生成[33]。NDRG4在許多腫瘤中的表達均降低，這表明它可能是抑癌基因。Melotte等[34]研究發現，與正常結腸組織相比，NDRG4在大腸癌中的表達降低，NDRG4的過表達可以在體外抑制集落形成以及細胞增殖和侵襲，表明NDRG4是大腸癌的抑癌基因。但是，尚無研究分析NDRG4在HCC中的預后價值，因此需要進一步闡明。

綜上，NDRG家族在HCC組織中的差異表達可能對其發生發展中起重要作用。NDRG1/3高表達和NDRG2低表達也可以作為分子標志物來鑒定HCC患者的高危亞組。NDRG1/2/3是HCC的潛在治療靶標，NDRG1/2/3可以作為HCC預后的一種標志物。