液相色譜-串聯質譜法同時測定水產品中阿維菌素、伊維菌素及四種三苯甲烷類殘留

袁斯甜，伍華雯，羅秋紅，黃海軍，吉麗華，占春瑞

（南昌海關技術中心，江西 南昌 330002）

阿維菌素（AVM）和伊維菌素（IVM）屬于阿維菌素類藥物（AVMs），是一種高效、廣譜的大環內酯類殺蟲藥物；孔雀石綠（MG）、結晶紫（CV）及其代謝物（隱性孔雀石綠LMG和隱性結晶紫LCV）是一種三苯甲烷類化合物，既是染料，也是一種抗菌、殺寄生蟲的藥物。兩類藥物價格低廉、用量少，并且具有很好的殺菌效果，廣泛應用于水產養殖業疾病防控[1]。研究表明：AVMs用作獸藥，代謝的藥物主要通過糞便以原型排出，嚴重污染水體，未代謝的藥物殘留在水產品中對水生生物以及人類帶來潛在的危害；另外三苯甲烷類化合物是一種致癌物質，在水生物體內殘留時間可達100 d以上，通過食物鏈對人類身體造成嚴重傷害，具有致畸、致癌等危害，我國將MG、CV也列入獸藥禁用藥清單[2]。為保障水產品質量以及水產養殖業的健康發展，需嚴格監控水產品中AVMs和三苯甲烷類殘留。

目前有關檢測AVM和IVM的方法多采用液相色譜-熒光法[3-8]，液相色譜-串聯質譜法[9-13]；孔雀石綠及其代謝物多采用液相色譜法[14-18]，液相色譜熒光法[19-21]，液相色譜-串聯質譜法[22-26]。目前AVMs殘留檢測方法大都建立在動物源性食品，而在水產品中研究報道甚少，并且同時測定水產品中阿維菌素、伊維菌素及四種三苯甲烷類殘留的方法尚未報道過。對于目前水產品中AVMs和四種三苯甲烷類藥物殘留，采用的是分類檢測，利用不同的檢測方法和前處理進行分類檢測，不僅耗時耗力、成本高，并且很難滿足大批量樣品檢測要求。因此，發展同時測定水產品中多獸藥殘留的方法已成為迫切需求。

該文基于固相萃取技術，結合液相色譜-串聯質譜法，建立了同時測定水產品中阿維菌素、伊維菌素及四種三苯甲烷類殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

4000Qtrap液相色譜－串聯質譜儀（AB Sciex公司）；Sartorious電子天平（精度 0.01 mg和 0.01 g）；SI G560E型旋渦混勻器；Eppendorf 5430R冷凍高速離心機；N-EVAP112氮吹濃縮儀；Visiperp DL固相萃取裝置；Alumina－N固相萃取小柱（1 g/3 mL）；有機系微孔濾膜0.2 μm。

阿維菌素、伊維菌素、孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結晶紫、隱性結晶紫六種標準物質和兩種氘代內標（MG－D5和LMG－D6）的純度均不低于98%。

標準儲備溶液：1 000 mg/L，分別稱取適量的上述六種標準物質和兩種氘代內標于10 mL容量瓶，用乙腈溶解并稀釋至刻度，-18℃保存于棕色玻璃瓶中。使用前用乙腈稀釋成合適濃度的混合標準使用液和混合內標標準使用液。

甲醇、乙腈、乙酸、無水乙酸銨均為HPLC純；試驗用水由Milli-Q超純水系統制備。

5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%乙酸）：稱取0.385 g無水乙酸銨溶解于900 mL水中，加入1 mL乙酸，用水定容至1 000 mL。

1.2 儀器檢測條件

1.2.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），柱溫 30 ℃；進樣量 10 μL；四種三苯甲烷類流動相A為乙腈，B為5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液，梯度洗脫程序為0～2.5 min，A由70%升至95%；2.5～7.0 min，A 保持 95%；7.0～7.1 min，A 由95%降至70%；7.1～15 min，A保持70%。AVMs流動相A為乙腈，B為水，其等度洗脫程序為0～5 min，A為95%。

1.2.2 質譜條件 四種三苯甲烷類為ESI正離子模式掃描（ESI+），多反應監測（MRM）模式，霧化氣壓力（GAS1）：45 psi，輔助氣壓力（GAS2）：55 psi，氣簾氣壓力（CUR）：10 psi，電噴霧壓力（IS）：5500 V；AVMs為APCI負離子模式掃描（APCI-），多反應監測（MRM）模式，霧化氣壓力（GAS1）：40 psi，輔助氣壓力（GAS2）：12 psi，氣簾氣壓力（CUR）：13 psi，電噴霧壓力（IS）：-4 500 V。

其他質譜參數見表1，其中帶*為定量離子。

表1 質譜參數

1.3 樣品前處理

取約500 g水產品肌肉組織，用高速勻漿機勻漿，制成魚糜樣品。

1.3.1 提取 稱取5.00 g魚糜樣品置于50 mL具塞塑料離心管中，加入40 ng孔雀石綠、隱性孔雀石綠混合內標，加入乙腈11 mL，渦旋混勻，均質提取30 s，4200 r/min離心5 min，上清液轉移至25 mL比色管中。另取一套離心管加入11 mL乙腈，洗滌均質刀頭，洗滌液提取殘渣一次，渦旋超聲5 min，4200 r/min離心5 min，合并提取液，用乙腈定容至25mL，搖勻備用。

1.3.2 凈化 移取上述5 mL提取液加入中性氧化鋁柱（預先用5 mL乙腈活化）中，用5 mL乙腈進行洗脫，上樣即接收。收集液于40℃下氮吹至干，加入1 mL乙腈－5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液（1+1），渦勻后過濾膜，進行液相色譜-串聯質譜儀測定分析。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

在魚糜陰性樣品中添加阿維菌素、伊維菌素及四種三苯甲烷類六種混合標準溶液。4.0 μg/kg AVMs色譜圖見圖1；0.5 μg/kg四種三苯甲烷類色譜圖見圖2。所有待測目標組分均能獲得最佳色譜分離效果且峰型尖銳，表明該方法能夠有效的分離水產品中AVMs和四種三苯甲烷類殘留，建立了水產品多藥殘同時檢測的簡便方法，為日常檢測節約成本，并且有效縮短檢測時間。

圖 1 4.0 μg/kg AVMs色譜圖

圖2 0.5 μg/kg四種三苯甲烷類色譜圖

2.2 提取試劑的選擇

綜合考慮AVMs和四種三苯甲烷類結構特點，均易溶于有機試劑。試驗常用的有機試劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯和二氯甲烷等。因此，該試驗分別采用這四種試劑對添加AVMs和四種三苯甲烷類標準物質的魚糜樣品進行提取。結果表明：乙酸乙酯和二氯甲烷對樣品中的目標物提取率低；甲醇和乙腈對四種三苯甲烷類提取效果好且無明顯差異，而對于AVMs，乙腈提取效果更好。相對乙腈，甲醇極性強更易將樣品基質中的極性雜質提取出來。因此，本試驗選擇乙腈作為提取試劑，能有效提取六種目標物并去除雜質的干擾。

2.3 凈化方式的選擇

該試驗選擇中性氧化鋁固相萃取柱，其能有效地適用于芳香烴以及酸堿溶液中不穩定的含酯化合物的分離，其試驗結果表明：采用中性氧化鋁固相萃取柱，添加回收高，且對提取液中油脂和雜質成分也有很好的凈化效果。另外，該試驗采用5 mL乙腈洗脫，可將固相萃取柱中殘留的目標物完全洗脫下來，防止過量的洗脫液將吸附的雜質洗脫下來。

2.4 流動相的選擇

從待測組分的分離效果和離子化效率選擇流動相。對于四種三苯甲烷類，采用的是ESI正離子模式掃描，流動相直接選用樣品上機的定溶液，即乙腈和5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液，由于這四種三苯甲烷類具有弱堿性，試驗表明流動相中加入適量的乙酸和低濃度的揮發性緩沖鹽可提高待測組分的離子化效率，待測組分得到了很好的色譜分離效果且峰性尖銳。AVMs采用的APCI負離子模式掃描，乙酸銨-0.1%乙酸體系呈弱酸性抑制AVMs離子化效率，采用乙腈和水流動相，5min等度洗脫程序即可將AVM和IVM有效的分離。

2.5 標準曲線和檢出限

考慮實際樣品測定，可能存在基質效應的影響。試驗分別采取純試劑和陰性基質樣品提取液配制相同濃度的混合標準工作溶液，在相同儀器條件下測定目標物的響應值并進行比較。試驗結果表明：純試劑配制的混合標準工作溶液的響應值和陰性基質提取液配制的響應值無明顯差異，故試驗選擇純試劑配制混合標準曲線。

采用純試劑配制成質量濃度為0.25/2.0、0.5/4.0、1.0/8.0、2.0/16、4.0/32 和 10/80 μg/L 的混合標準工作溶液，按照標準方法測定，AVMs采用外標法，在2.0～80 μg/L質量濃度范圍呈線性，檢出限為4.0 μg/kg；四種三苯甲烷類采用內標法，在0.25～10 μg/L質量濃度范圍內具有良好的線性相關，檢出限為0.5 μg/kg。其六種目標待測物線性參數和檢出限見表2。

2.6 精密度與回收試驗

分別在魚糜陰性樣品中添加3個濃度水平的AVMs和四種三苯甲烷類六種混合標準溶液，按實驗方法和儀器條件進行測定，分別計算六種目標物的加標回收率和相對標準偏差RSD（n=6），結果見表3。六種目標物的平均回收率為89.8%～113%，RSD為1.4%～10%，表明該試驗方法的回收率和重現性好。

表2 線性參數和檢出限

表3 加標回收率和精密度（n=6）

3 結論

該文建立了液相色譜-串聯質譜同時測定水產品中阿維菌素、伊維菌素及四種三苯甲烷類藥物殘留。從試驗結果來看，準確性、靈敏度、精密度和檢出限均滿足獸藥殘留檢測要求，從而說明同時測定水產品中AVMs和四種三苯甲烷類殘留的方法是有效可行的，并且本方法大大減少日常檢測時間與成本，為日常水產品中多獸藥殘留分析提供有利檢測手段。