基于網絡藥理學探討血必凈注射液治療新型冠狀病毒肺炎機制＊

孔 藝，林莉莉，陳 永，賴 莎，吳紅衛，陳吉生

（廣東藥科大學附屬第一醫院藥學部 廣州 510080）

2019年12月，武漢市爆發了由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）。COVID-19具有傳播迅速廣泛、傳染性強、各類人群普遍易感的特點，輕癥患者出現發熱、乏力、干咳等癥狀，嚴重者可出現呼吸困難、呼吸窘迫綜合征或膿毒癥休克等，臨床尚無針對性的特效藥物[1-3]。截至2020年3月19日，全球COVID-19病例已超過20萬，有8000多例死亡。我國首次報告無新增本土病例，這是一個驚人的成就[4]。

2020年2月20日，國家中醫藥管理局黨組書記、副局長余艷紅表示，堅持中醫藥治療COVID-19取得顯著成效。截至2020年3月22日，國家衛生健康委先后發布了七版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》，將血必凈注射液納入治療重型（氣營兩燔證）和危重型（內閉外脫證）COVID-19方案中[5]。中央指導組專家組成員、東南大學附屬中大醫院副院長邱海波表示，中藥血必凈注射劑對新冠肺炎患者效果良好。有相關研究表明，血必凈注射液能夠對冠狀病毒導致的炎癥因子風暴或者炎癥反應有抑制作用，對新型冠狀病毒也有一定的抑制作用[5]。

現代藥理學對血必凈注射液的研究局限于單一成分和單一靶標，而中藥網絡藥理學這一新領域的研究旨在從系統層次和分子水平揭示中藥方劑的奧秘，促進中藥研究從當前的“單一靶標，單一藥物”模式轉向“網絡靶標，多成分藥物”的新模式。研究結果表明，中藥網絡藥理學能夠為中醫學從基于經驗的醫學邁向基于證據的醫學提供新的途徑，同時改進當前的藥物研究策略[7-9]。本研究通過網絡藥理學分析血必凈注射液體內有效成分的潛在作用靶點、作用通路及生物過程等信息，從分子層面闡釋其治療COVID-19的機制。

1 材料與方法

1.1 篩選活性成分和靶蛋白

本研究通過檢索國內外文獻，篩選血必凈注射液在體內外通過LC-MS方法均能定量檢測到的化學成分。經Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）驗證和轉化，然后在TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem、TargetNet[10]（http://targetnet.scbdd.com/）和Similarity Ensemble Approach數 據 庫（SEA,http://sea.bkslab.org/）獲取化合物對應的靶點蛋白，同時使用蛋白質數據庫UniProt（http://www.uniprot.org/uploadlists/）轉換為統一基因名稱。

1.2 新型冠狀病毒肺炎相關靶點搜集

Genecards數據庫（https://www.genecards.org/）是一個可提供基因組、蛋白質組、轉錄、遺傳及功能上所有已知人類基因的平臺[11]。以“novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞，搜集COVID-19相關的靶點信息。將在Genecards數據庫中檢索得到的冠狀病毒靶點與血必凈注射液的靶點在Venny 2.1.0中映射篩選出共同靶點，將其作為血必凈注射液的抗病毒靶點，導入Cytoscape 3.2.1中構建化合物-抗病毒靶點網絡，運用“Network Analyzer”功能分析其拓撲學屬性。

1.3 中藥-化合物-靶點-疾病網絡構建

將血必凈注射液活性成分及其相應靶點導入Cytoscape 3.2.1中，構建血必凈注射液中藥-化合物-靶點-疾病網絡，導出其相關的拓撲數據如度值、介數等，并運用“Network Analyzer”功能分析其拓撲學屬性。度值和介數是評價一個節點在網絡中比重的重要拓撲學參數。度值可反映網絡中某節點與其他節點的鏈接數目，介數反映了網絡中所有最短的路徑中經過該節點的路徑的數目與最短路徑總數的比值。

1.4 構建靶點相互作用網絡

為明確血必凈注射液潛在治療COVID-19靶點及靶點之間的相互作用，本研究將篩選出的靶點導入STRING網絡平臺（https://string-db.org/）中構建靶點相互作用網絡圖（protein-protein interaction，PPI）。把蛋白種類設置為“Homo sapiens”，將評分條件（置信度）設定＞0.9，采用“Cytohubba”插件對“degree”進行分析，確定血必凈注射液治療COVID-19的核心靶點。

1.5 KEGG信號通路和GO生物過程富集分析

利用Cytoscape中的“ClueGO 2.5.5”插件對“1.2”和“1.3”中得到的血必凈注射液核心靶點，進行GO生物過程和KEGG信號通路富集分析。GO富集可了解靶點主要的作用過程，KEGG通路通過觀察靶點在通路中的分布情況，可進一步了解該靶點在代謝、信號轉導等通路中的作用。以P＜0.05進行靶基因篩選，得到血必凈注射液發揮作用的主要信號通路及參與的生物過程。

1.6 構建血必凈注射液作用靶點通路圖

本研究采用KEGGMapper功能，將選擇的活性成分作用靶點在與免疫相關的作用通路上標注出來，驗證血必凈注射液通過多靶點、多途徑抗炎的作用機制。

2 結果

2.1 血必凈注射液候選化合物和對應人類靶點篩選結果

通過檢索國內外文獻[12-22]，篩選出血必凈注射液中和體內均能定量檢測到的36個主要活性成分（表1）。其中，紅花有5個化學成分，赤芍10個化學成分，丹參13個化學成分，當歸1個化學成分，川芎和當歸共有2個化學成分，丹參和紅花共有3個化學成分，丹參和當歸共有2個化學成分。本研究采用TCMSP、PubChem、TargetNet和SEA數據庫預測靶點，并經Uniprot校正后共獲得447個靶點。

2.2 構建中藥-化合物-靶點-疾病網絡

以“novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞，在Genecards數據庫中挖掘出與COVID-19相關靶點259個。將血必凈注射液的447個作用靶點與259個COVID-19相關靶點在Venny 2.1.0中映射得出70個共同靶點，將候選化合物與70個靶蛋白導入Cytoscape軟件，去除與靶點無交集的孤立成分，繪制網絡圖（圖1），網絡中共有94個節點（其中24個化合物節點及70個靶蛋白節點）和222條邊。每個候選化合物平均作用于2.917（70／24）個靶點，而每個靶蛋白平均連接藥物的數量為3.171（222／70），說明了血必凈注射液是通過多成分-多靶點整體發揮作用。結合網絡拓撲學分析，該網絡圖的網絡集中度為0.432、網絡密度為0.051、網絡異質性為1.320、最短路徑為8742。節點的度值（Degree）和介值中心度（Betweenness Centrality）是描述網絡節點重要性的常用指標[23]。在圖1中，節點的平均度值為4.7234，大于該平均度值的節點有30個；節點平均介值中心度為0.020463，大于該平均介值中心度的節點有22個。共有21個節點的度值和介值中心度均高于均值（見表2），其中化合物有10個，靶蛋白有11個。化合物分別為槲皮素（A3）、沒食子酸（A11）、木犀草素（A32）、迷迭香酸（A28）、蘆丁（A33）、山萘酚（A2）、綠原酸（A34）、丹參酮IIa（A19）、羥基紅花黃色素A（A1）和芍藥苷（A5）。靶蛋白分別是

表1 血必凈注射液中有效化學組分

PTGS2、PTGS1、CASP3、RELA、TNF、HMOX1、MAPK1、IL6、NOS2、NOS3和PPARG。

圖1 中藥-化合物-靶點-疾病網絡圖

表2 血必凈注射液成分-靶點網絡關鍵節點及其拓撲學特征

2.3 構建PPI網絡

為更好地探討血必凈注射液的作用機制，將血必凈注射液70個新型冠狀病毒肺炎相關靶點蛋白輸入STRING數據庫，構建靶蛋白相互作用PPI網絡（圖2）。該網絡共有68個節點，222條相互作用關系，平均度值為6.53。將在STRING平臺中構建的PPI網絡數據導入Cytoscape 3.2.1中，利用Cytohubba插件中的Degree降序排列篩選出大于平均度值的核心靶點24個，圖3為排名前十的核心靶點。

2.4 GO生物過程分析

綜合2.2和2.3中所得到的32個（其中IL6、RELA和MAPK1重復）血必凈注射液關鍵靶點，進行GO生物過程富集分析，篩選出P＜0.05的生物過程91個。利用Cytoscape插件“ClueGo”得出GO生物過程富集分析的可視化結果，如圖4所示。涉及細胞因子活性、脂多糖細胞應答、細胞因子生物合成過程調控和神經炎癥反應調節等生物過程，這些通路即是血必凈注射液重要靶標干預的生物學過程。

2.5 KEGG信號通路富集分析

對32個血必凈注射液關鍵靶點進行KEGG信號通路富集分析，篩選出P＜0.05的信號通路110條，利用Cytoscape插件“ClueGo”得出KEGG分析的可視化結果，如圖5所示，涉及IL-17信號通路、甲型流感、乙型和丙型病毒性肝炎及炎性腸病等通路。圖6為血必凈注射液活性成分對IL-17信號通路作用靶點標注圖。

3 討論

圖2 血必凈注射液相關靶點的PPI網絡圖

圖3 血必凈注射液核心靶點

血必凈由紅花、赤芍、川芎、丹參和當歸組成，紅花中的黃酮類化合物、赤芍中的單萜苷類、川芎/當歸苯并呋喃酮類和丹參中的兒茶酚類化合物在XBJI中發揮重要作用，并于2004年批準為國家二類新藥，是我國唯一被批準治療膿毒癥、全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征的中成藥[24-25]。一項發表于國際重癥醫學權威期刊Critical Care Medicine的研究表明，血必凈注射液具有降低重癥肺炎病死率的臨床價值[26]。但因成分復雜，其具體藥效成分、藥理作用尚無法準確闡明。

從網絡藥理學分析結果可知，血必凈注射液有效成分綜合評分最高的10個化合物分別屬于黃酮類、酚酸類、菲醌類、查爾酮苷類和單萜苷類，提示其是血必凈注射液發揮療效的重要活性成分。此外，血必凈注射液治療COVID-19可能與PTGS2、PTGS1、CASP3、RELA、TNF、MAPK1、IL2、IL6和IL10靶點有關，這些靶點都在炎癥的病理過程中起重要作用。COVID-19的嚴重程度與病毒和機體炎癥反應的強度相關，如患者體內出現過度的炎癥反應，即“細胞因子風暴（cytokine storm）”，將可能導致嚴重的后果甚至死亡。武漢金銀潭醫院一項發表于The Lancet的臨床研究[27]發現，重癥患者血漿中IL2，IL7，IL10，GSCF，IP10（CXCL10），MCP1(CCL2)，MIP1A(CCL3)和TNFα顯著高于非重癥患者。血必凈注射液主要通過抑制血清中IL6、TNFα、MCP1，MIP2和IL10減輕炎癥反應。另一方面，有研究認為[29]，SARS-CoV-2與SARS-CoV兩種病毒感染的途徑均通過其表達的S-蛋白與人體內血管緊張素轉化酶（ACE2）結合，導致病毒侵入機體而致病。冠狀病毒的3CL水解酶（也稱Main proteinase，Mpro）通過對pp1a（相對分子質量486 000）和pp1ab（相對分子質量790 000）2種多聚蛋白復制酶泛水解，在介導病毒復制和轉錄功能中發揮關鍵作用，是治療SARS和其他冠狀病毒的理想靶點[30-31]。更重要的是，槲皮素、木犀草素和山柰酚與ACE2和SARS-CoV-2 3CL水解酶均具有良好的結合能力[32-34]。以上結果說明，血必凈注射液不僅可通過調控炎癥通路，還可能通過抑制病毒入侵和復制，發揮治療COVID-19的作用，體現了血必凈注射液多成分、多靶點協同作用的特點。

圖4 GO生物過程分析

圖5 KEGG信號通路富集分析

圖6 血必凈注射液活性成分在免疫相關通路中的作用靶點標注圖

進一步分析血必凈注射液GO生物過程和KEGG信號通路富集結果，本研究通過GO生物過程富集分析發現血必凈注射液靶點主要涉及細胞因子活性、脂多糖細胞應答、細胞因子生物合成過程調控和神經炎癥反應調節等生物過程。KEGG信號通路富集在IL17信號通路、甲型流感病毒、乙型和丙型病毒性肝炎及炎性腸病等通路。SARS-CoV-2感染導致強烈的免疫反應和炎癥風暴，此過程中大量細胞因子被激活，與SARS-CoV相似。特別地，Th17細胞的主要功能是促進中性粒細胞的動員、募集和活化，介導促炎癥反應，一系列細胞因子如TGFB、IL6、IL9、IL1、IL23、IL21、IRF4、STAT3參與了Th17細胞分化過程。血必凈注射液的多通路可能通過調控免疫和炎癥相關的信號通路，起到抑制活化的細胞因子、緩和過激的免疫反應、消除炎癥的作用。

綜上所述，血必凈注射液的調控過程除了針對SARS-CoV-2結構上的3CL水解酶，更注重在病毒入侵后對宿主自身免疫抗感染能力的調控和干預。因此，血必凈注射液通過多成分、多靶點和多通路的共同作用治療COVID-19。鑒于網絡藥理學的局限性，后期還將對通路進行驗證，為血必凈注射液治療COVID-19提供實驗依據。