基于網絡藥理學及高通量分子對接研究金花清感顆粒中結合SARS-CoV-2特定靶蛋白的活性化合物干預COVID-19的潛在分子機制＊

沈 浮，付中應，吳泳蓉，李 玲，趙昱東，夏 雨，鄺高艷＊＊

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院 長沙 410005；3.湖南中醫藥大學 長沙 410208；4.成都中醫藥大學 成都 610075）

近期爆發的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情，是由人類新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染引起的國際關注的突發公共衛生事件，SARS-CoV-2強大的感染潛力引起人們極度恐慌[1-2]。截至2020年3月15日，全球COVID-19累計病例數已突破15萬例，死亡人數達5000余人[3]。COVID-19感染初期多伴有發熱、乏力、干咳等臨床表現，重癥患者可出現呼吸困難與低氧血癥，甚至急性呼吸窘迫綜合征等[4]。針對COVID-19的治療，目前尚無特效藥物及疫苗，許多治療藥物選擇都來自既往冠狀病毒感染的臨床治療經驗[5-6]。SARS-CoV-2是一種正鏈單股RNA冠狀病毒，SARS-CoV-2 3CL水解酶是病毒復制過程中所需要的一個重要酶，其能夠將病毒復制酶多聚蛋白切割成必需的功能蛋白，如果SARS-CoV-2 3CL水解酶的功能抑制，病毒復制就可以得到有效遏制[7-8]。血管緊張素轉換酶2（ACE2）是SARS-CoV-2進入宿主細胞的關鍵受體[9]，SARS-CoV-2與SARS-CoV相類似，均利用其表達的S-蛋白與體內ACE2結合，導致病毒侵入機體[10-11]，并且SARS-CoV-2與ACE2受體結合的親和力是SARS-CoV的10-20倍[12]，SARS-CoV-2下調ACE2的表達，使ACE-Ang II軸失衡，導致促炎因子表達升高，誘發炎癥風暴，出現全身炎癥反應，加速病情進展[13]。因此，以SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體為靶標篩選干預COVID-19的藥物并探討其機制有著十分重要的意義。

中醫藥在預防和治療流行性疾病中發揮著不可或缺的作用。2003年SARS流行期間，中醫藥的干預取得了顯著的療效[14]。金花清感顆粒由北京市中醫藥管理局中醫學專家參考《瘟疫論》《傷寒論》和《溫病條辨》等古籍，設計、優化并逐步研發的用于流感風熱犯肺證治療的新藥[15]。雖然COVID-19傳染性較高，但絕大部分患者癥狀較輕，治療方案以口服藥物為主。本次疫情期間金花清感顆粒亦被納入《新型冠狀病毒肺炎診療方案》的推薦中成藥物中[16]，根據張伯禮院士介紹，金花清感顆粒在治療輕度、普通型的新冠肺炎方面療效確切，體現在退熱的時間、癥狀的改善以及炎癥的吸收上，輕癥的轉重比例也有所下降，并且能顯著緩解患者心理焦慮[17-18]。

然而，金花清感顆粒抗病毒相關機制研究缺乏文獻報道，且金花清感顆粒成分復雜，系統地闡明復方各組分及其在疾病中的作用機理是非常困難的。隨著各種高通量組學技術的迅速發展，網絡藥理學及分子對接技術為探索中藥復方的科學依據提供新的方法和機遇[19]。網絡藥理學在復雜的生物系統基礎上通過對生物分子網絡中病證與方藥的關系進行機制性的計算、分析與預測，以期發現藥效物質及復方的作用機制[20]。分子對接通過化學計量學方法模擬分子的幾何結構和分子間作用力來進行分子間相互作用識別并預測受體-配體復合物結構，準確預測蛋白質復合物的結構和結合位點，為藥物篩選及設計提供新的思路[21]。本研究從干預SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體的角度，利用網絡藥理學及高通量分子對接技術金花清感顆粒中有效活性化合物進行篩選，并預測其治療COVID-19的機制。

1 材料與方法

1.1 數據庫及工具

本研究所涉及的數據庫有TCMSP（計算系統生物學實驗室數據庫和分析平臺，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、String數 據 庫（https://string-db.org/）、Uniprot（https://www.uniprot.org）、PubChem（有機小分子生物活性數據庫，http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、Protein Data Bank（PDB，https://www.rcsb.org/）。數據分析工具有Cytoscape-3.7.0（CentiScape插件）、R語言3.6.2程序（bioconductor等數據包）、SYBYL-X 2.1.1軟件。

1.2 金花清感顆粒藥物活性成分虛擬篩選及靶標預測

通過TCMSP數據庫進行檢索，本研究收集并以類藥性≥0.18和口服生物利用度≥30%為標準[22]，篩選得到金花清感顆粒有效活性成分及對應靶標，并利用Uniprot數據庫將靶標名稱進行注釋。

1.3 藥物-活性化合物-靶標模型構建

將藥物與有效活性化合物及對應的靶標相映射，構建“藥物-活性化合物-靶標”調控網絡模型利用Cytoscape-3.7.0軟件進行可視化。其中節點的類型代表藥物、活性化合物及交集靶標，利用“CentiScape”插件計算有效成分的DC（度）值，度值越大提示發揮主要功能的概率越大[23]，以2倍度值中位數為最低標準篩選金花清感顆粒的核心化合物。

1.4 SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接活性化合物篩選

為篩選與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接活性較高的核心化合物，利用SYBYL-X 2.1.1軟件中Surflex-dock模塊，對有三維結構靶標蛋白及活性化合物進行對接分析驗證，對接過程基于結構相似性和形狀相似性來進行匹配，具有準確度高、真陽性率高、速度快的特點[24]。結合自由能越小，配體與受體結合越穩定，故Total score值越大，配體與受體結合越穩定。一般Total score大于5.0的說明分子與靶點有較好的結合活性[25]，故以此為標準來篩選得到金花清感顆粒中與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接活性較高的化合物。

1.5 蛋白網絡互作（PPI）及核心靶蛋白預測

將金花清感顆粒中與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接活性較高的化合物的靶基因導入STRING數據庫獲取交集靶標的蛋白網絡互作關系，此時限定物種為“智人”，設置置信度為0.9（高等），隱藏游離節點[26]，將結果導入Cytoscape-3.7.0進行可視化，并以2倍節點度值（degree）的中位數為最低標準篩選核心靶標蛋白。

圖1 金花清感顆粒藥物有效活性成分及對應靶標分布情況

1.6 相關靶標的KEGG富集分析

為進一步探討金花清感顆粒中與SARS-CoV-2水解酶及其ACE2受體結合密切的化合物干預COVID-19的生物學過程，本研究利用R語言3.6.2程序基于“bioconductor”數據包提取信息，將金花清感顆粒涉及的靶標進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，以P（Value）＜0.05為差異有統計學意義，按照富集基因數目進行排序，選取前20條通路繪制氣泡圖進行展示。

2 結果

2.1 金花清感顆粒藥物活性化合物篩選及靶標預測結果

通過檢索TCMSP數據庫，最終篩選收集到金花清感顆粒藥物中11味藥（石膏未收集在數據庫內）所含的活性化學成分共276種，其中：金銀花（JYH）23個、麻黃（MH）22個、杏仁（XR）12個、黃芩（HQ）32個、連翹（LQ）23個、浙貝母（ZBM）17個、知母（ZM）15個、牛蒡子（NBZ）8個、青蒿（QH）22個、薄荷（BH）10個、甘草（GC）92個。藥物活性化合物分布情況中，甘草、黃芩、連翹、金銀花的比重較大，如圖1A所示。活性化合物共涉及靶基因325個，在靶標分布情況中，連翹、金銀花、青蒿涉及的靶標數目分別是205個、196個、196個，如圖1B所示。

2.2 藥物-活性化合物-靶標模型構建結果

將篩選得到的化合物及對應靶標導入Cytoscape 3.7.0軟件，對不同化合物進行屬性注釋，構建“藥物-活性化合物-靶標”模型，利用“CentiScape”插件計算有效成分的度值，按照大小進行排序，其值越大表示該節點參與該模型發揮的作用程度越高，代表該活性化合物能夠作用于更多的靶點，在治療疾病時與藥物作用關系越密切。如圖2所示，該模型中化合物節點度值中位數為42，大于中位數2倍值的化合物共有10種，分別槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempfero）、柚皮素（naringenin）、異鼠李素（isorhamnetin）、芒柄花黃素（Formononetin）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、甘 草 查 爾 酮 B（Licochalcone B）、粗毛甘草素C（Glyasperin C）、甘草查爾酮A（licochalcone a）、3-甲氧基光甘草定（3'-Methoxyglabridin）。靶標節點度值排名前5的是HSP90AA1、CALM1、AR、NOS2、ESR1。

2.3 SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接活性化合物篩選結果

將金花清感顆粒中的核心活性化合物（因TCMSP數據庫無石膏藥物，此處將石膏納入分子對接進行篩選）與SARS-CoV-2 3CL水解酶（PDB ID：6LU7）及ACE2受體（PDB ID：1R42）進行分子對接，結果如表1所示，采用目前臨床使用的抗新型冠狀肺炎有效藥物進行參照，在SARS-CoV-2 3CL水解酶組中金花清感顆粒中3-甲氧基光甘草定、粗毛甘草素C、甘草查爾酮B具有對接較好的結合活性，其中粗毛甘草素C的Total score為6.31，超過達蘆那韋的Total score，說明其與SARS-CoV-2 3CL水解酶的結合匹配度較高。在ACE2受體組中金花清感顆粒核心化合物中Total score大于5.0有8種，分別是槲皮素、柚皮素、異鼠李素、芒柄花黃素、甘草查爾酮B、粗毛甘草素C、甘草查爾酮A、3-甲氧基光甘草定，其中甘草查爾酮B對接匹配度最佳。

圖2 金花清感顆粒“藥物-化合物-靶標”網絡模型

在圖3中，粗毛甘草素C通過氨基酸殘基LYS137、GLY138、ASP289、GLU288、LYS5形成5條氫鍵（圖3A），3-甲氧基光甘草定通過氨基酸殘基LEU287、THR199形成2條氫鍵（圖3B），均能很好地與SARS-CoV-2 3CL水解酶密切結合。甘草查爾酮B通過殘基ASP382、ARG514、ASP206形成3條氫鍵（圖3C），粗毛甘草素C通過氨基酸殘基ASN394、ASP382、GLU402、ARG514、GLU398形成5條氫鍵（圖3D）與ACE2受體進行緊密結合，并均能被直徑為5A的蛋白活性口袋良好的包裹。

2.4 蛋白網絡互作及核心靶蛋白預測結果

將金花清感顆粒中與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接活性較高的化合物的對應靶基因在STRING平臺進行PPI網絡分析，如圖4A所示，PPI網絡圖中包含節點數目為81個，204條邊，其中節點表示靶蛋白，節點顏色越深代表節點度值越高，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關系，線條越多表示關聯度越大。靶蛋白平均節點度值為5，超過平均2倍度值的靶蛋白有10個，如圖4B所示，排名前3的是AKTI、HSP90AA1、RELA，說明這些靶蛋白是PPI網絡中的關鍵靶點，金花清感顆粒中與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接活性較高的化合物可能通過這些靶蛋白治療COVID-19。

2.5 相關靶標的KEGG富集分析結果

根據P（Value）＜0.05為篩選條件，KEGG通路富集篩選得到94條信號通路，以富集基因數目進行排序，排名前20的通路如圖5所示，金花清感顆粒中與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接活性較高的化合物干預COVID-19涉及的途徑主要包括5條病毒相關通路（卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、丙型肝炎、麻疹、人巨細胞病毒感染、EB病毒感染）以及IL-17通路、TNF通路、AGE-RAGE等相關途徑。

3 討論

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）屬于中醫學“瘟疫”“疫病”“疫癘”等范疇，本次疫情恰逢己亥年終之氣異常溫暖的氣候，風熱異氣從生，侵襲機體，加之感受外來疫毒之邪為重要病因。風熱疫毒襲表，肺衛奮起反抗，衛氣不固，疫毒入里化熱，肺失宣降，為早期出現發熱、咳嗽、咳痰的重要病機。中醫藥對改善COVID-19患者全身狀況、減輕癥狀、縮短病程發揮重要作用[27]。在發病之初，治療多以辛涼解表合清熱解毒之法[28]。金花清感顆粒是在甲型流感期間經過篩選并且在發熱時間和發熱癥狀消失率方面具有獨特療效的藥物[29]，其組方來源于銀翹散和麻杏石甘湯合方加減，由金銀花、石膏、蜜麻黃、知母、連翹、苦杏仁、黃芩、牛蒡子、薄荷、青蒿、浙貝母和甘草共12味中藥組成，具有疏風宣肺、清熱解毒之功效[30-31]。現代藥理學研究顯示，金花清感顆粒可以降低病毒性肺炎患者的血清CRP、IFN-γ水平，改善炎癥反應癥狀以及提高免疫能力[31]。金花清感顆粒中君藥金銀花抗病毒作用與抑制病毒吸附、阻斷病毒蛋白質復制、抑制病毒粒子組裝等多種藥理活性有關[32]。黃芩可以降低病毒性肺炎組織中促炎性細胞因子TNF-α，IL-1，IL-6的蛋白與基因表達，從而達到促進肺組織炎性病變的修復的作用[33]。故金花清感顆粒具有良好的抗病毒作用，療效確切。

表1 金花清感顆粒中的核心活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接Total score

圖3 金花清感顆粒中核心活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接情況

圖4 金花清感顆粒中干預特定靶蛋白的化合物的PPI網絡及核心靶蛋白

圖5 金花清感顆粒中干預特定靶蛋白的化合物的KEGG富集分析氣泡圖

通過“藥物-活性化合物-靶標”網絡預測圖中發現槲皮素、山奈酚、柚皮素等11個化合物的度值為平均度值的兩倍，提示其為金花清感顆粒的關鍵活性成分。其中槲皮素是度值最高的有效成分，根據現代藥理學研究顯示，槲皮素可通過抑制Caspase-3含量或活性而發揮對于肺部的甲型流感病毒H1N1的抑制作用，并且可以調節血清中的炎性細胞水平，改善肺部炎癥表現，而且其細胞毒性較利巴韋林低[34-36]。山奈酚具有一定的急性肺損傷的保護效應，其能夠通過抑制 肺 組 織 促 炎 因 子NF-κB、IL-1β、HO-1、PTGEs、iNOS、TNF-α和COX-2mRNA的表達能夠對急性肺損傷引起的氧化-抗氧化平衡失調起到明顯的抑制作用[37]。柚皮素具有廣泛的藥理活性，柚皮素通過NFκB途徑抑制炎癥細胞浸潤、炎癥介質的釋放降低了中性粒細胞募集到肺和嗜中性粒細胞介導的氧化損傷，從而有效減弱肺部炎癥損傷[38-39]。金花清感顆粒的關鍵活性成分多數為黃酮類化合物，這與大多數抗病毒類中藥的主要成分相吻合[40]，從物質基礎層面奠定了金花清感顆粒抗病毒的切實有效性。

在金花清感顆粒的有效活性成分與SARS-CoV-2特定靶蛋白高通量分子對接篩選中結果中，共有8種有效活性成分與靶蛋白緊密結合，而其中粗毛甘草素C、甘草查爾酮B與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體蛋白上關鍵氨基酸均產生的較多氫鍵作用，結合穩定，可能在金花清感顆粒中發揮較為理想的SARSCoV-2 3CL抑制作用及ACE2受體阻斷功效。粗毛甘草素C的與SARS-CoV-2 3CL水解酶結合度甚至超過達蘆那韋，說明其與SARS-CoV-2 3CL水解酶的結合匹配度較高，一定程度上從分子層面間接反映金花清感顆粒干預COVID-19的潛在機制。粗毛甘草素C、甘草查爾酮B均來自甘草，目前關于甘草抗病毒作用相關文獻報道較多，有報道顯示，在SARS病人身上分離出兩種冠狀病毒FFM-1和FFM-2感染的Vero細胞中，甘草素對病毒的抑制作用最強，并且還可以抑制病毒復制過程中早期的吸收和穿透等階段[41]。但本課題組目前暫未發現關于粗毛甘草素C、甘草查爾酮B抑制病毒的相關基礎研究報道，其可能是金花清感顆粒中潛在的抗病毒活性成分。因此，采用網絡藥理學及高通量分子對中藥干預特定靶標的有效活性成分進行預測，可以促進中藥高效合理地配伍使用，并且對新型抗病毒藥物的篩選與研發具有一定的指導意義。

在PPI及核心網絡預測中，金花清感顆粒中與SARS-CoV-2特定靶蛋白對接良好的化合物主要涉及AKTI、HSP90AA1、RELA等核心靶蛋白，且大多數與炎癥反應相關。其中AKT是PI3K下游信號通路的重要的靶信號分子，其能結合目的基因刺激轉錄發生，從而調控炎癥因子的合成和釋放，與肺組織病理性損傷嚴重程度密切相關[42]。COVID-19患者面臨的社會壓力較大，甚至出現恐懼、緊張不安等應激情緒[43]，抑郁緊張等情緒可能通過慢性應激反應誘發體內熱休克蛋白HSP90AA1高表達[44]，這與金花清感顆粒能緩解患者焦慮的作用相符合[17]，通過干預HSP90AA1的表達是其緩解焦慮癥狀的可能機制。RELA是炎癥通路NF-κB家族重要成員，在中性粒細胞的凋亡中有重要地位。活化的中性粒細胞能夠分泌INF-γ、IL-6等炎性因子[45]。活化的MAPK可涉及一系列上游影響因子和下游作用底物如IL-8、調節活化正常T細胞表達和分泌因子等，增加肺部的炎癥反應和氣道高反應性[46-47]。在KEGG通路富集分析中，金花清感顆粒中與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體相關核心化合物有5條通路與病毒有密切聯系，其與抗病毒通路上有著良好的基因富集性，提示金花清感顆粒抑制SARS-CoV-2復制可能與這些途徑相關。此外IL-17、TNF通路也與之相關，IL-17對炎癥細胞有強大的趨化作用，可以顯著增加氣道內炎癥細胞募集，釋放促炎性因子，間接導致肺部組織浸潤和損害[48]。TNF可有效刺激機體內分泌大量IgG及促進B細胞增殖，激活內皮細胞及中性粒細胞表面黏附受體，導致肺損傷，體現了金花清感顆粒干預COVID-19多靶點、多通路以及多生物學途徑特點。

然而，本研究也有一定局限：第一，在對金花清感顆粒有效成分的獲取時納入的數據庫較為單一，單一數據庫對于藥物的有效成分可能存在收集不全、準確性不高等局限，并且未納入石膏的活性成分及其干預的靶標，這與臨床實際配伍干預COVID-19的情況存在偏倚，后期研究可以通過液相色譜等方法來提高活性成分提取的準確性。第二，金花清感顆粒中龐大的化學組分在體內的生物學效應是非常復雜的，對于各成分之間的是否具有協同增效或拮抗作用，可能仍需要進一步實驗研究來驗證。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學和高通量分子對接技術對金花清感顆粒中干預SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體酶的活性化合物進行篩選，并對其治療COVID-19的靶標預測與機制進行預測，揭示了金花清感顆粒治療COVID-19“多成分、多靶點、多通路”的特點。目前COVID-19的致病機制尚不清楚，從干預SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體酶角度研究中藥復方可以為干預COVID-19的藥物篩選和臨床治療提供參考。