基于干眼癥細胞凋亡模型觀察淫羊藿總黃酮含藥血漿對foxp3mRNA的作用＊

王 方，萬咪咪，盧書娟，胡文婧，石玉恒

（1.貴州中醫藥大學第二附屬醫院眼科 貴陽 550003；2.貴州中醫藥大學 貴陽 550003）

干眼癥是一種慢性眼表疾病，據統計全球有超過10億干眼患者，發病率約為5.5%～33.7%，而我國干眼患者人數就超過1億人，患病率占21%～30%。眼科門診30%的病人以“眼干、眼澀”為主癥前來就診，已成為目前患病人數最多的眼科慢性病，因此，患者本人和社會醫療都投入非常大的資金來投入干眼的治療。干眼癥是由許多要素引起的眼表疾病?；颊叱霈F長期疲勞、瘙癢、疼痛等刺激癥狀為主要臨床表現，嚴重擾亂患者的正常生活。免疫相關的炎癥反應是干眼發病中的關鍵要素，大量炎癥因子被激活，加速淚腺、角結膜上皮細胞凋亡[1]，使眼球的表面功能受到侵害，淚膜的相對穩定性降低[2]。早在《本草綱目》中就有對淫羊藿治療眼疾的記載，大量研究證實淫羊藿苷具有調節免疫系統功能的活性[3]。為中藥干預免疫炎癥所致的干眼癥開辟了新的機會，在此基礎上，本研究觀察了淫羊藿總黃酮含藥血漿對干眼癥細胞凋亡模型免疫反應相關因子的影響。

1 和實驗材料和操作步驟

1.1 實驗動物

本研究實驗動物約2.0～2.5 kg/只的一個月齡遠交系新西蘭大耳雄兔，用普通飼料喂養。

1.2 主要試劑、耗材和儀器

本研究的主要試劑、耗材和儀器：DMEM/F12（Hyclone，SH30023.01B）、胎 牛 血 清（Hyclone，SH30070.03）、青霉素/鏈霉素（Hyclone，SV30010/100 mL）、胰酶（Hyclone，SH30042.01/100 mL）、10%水合氯醛（100 mL蒸餾水，完全溶解10 g水合氯醛）、3.8%枸櫞酸鈉溶液（100 mL蒸餾水加入3.8 g枸櫞酸鈉）、PBS（南 京 生 興 物，SN331SN331）、DMSO（sigma，C6295C6295-50 mL）、SYBR?Premix Ex Taq（Takara，RR820A，即SYBR green溶液）、RNAiso Plus（Takara，9108，即Trizol）、氯仿（Trichloromethane，上海阿拉丁生化，C128130）、異丙醇（isopropanol，上海阿拉丁生化，I112011）、乙醇（ethanol，上海阿拉丁生化，E111989）、DEPC（Diethyl pyrocarbonate，上 海 阿 拉 丁 生 化，D105557）、MTT（biosharp，5 g）、PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，RR047A）、CO2培養箱（Thermo fisher，3131）、離心機（北京醫用離心機廠生產）、0.45μm手控式負壓過濾器（長沙鵬程生物有限公司）、超低溫冰箱（沈陽市醫療設備生產廠）、血球計數板（上海求精生化）、酶標儀（Thermo fisher，Multi Multiskan skan 51119000）、Stepone plus熒光定量PCR（ABI）、PCR儀（ABI，Veriti）、Nano drop 2000（Thermo fisher）、引物（引物序列見表1）。

表1 引物

1.3 雄兔淚腺上皮細胞的原代培養

取健康1月齡、雄性新西蘭大耳白兔（2.02.5 kg/只）1只，經空氣栓塞法處死后無菌操作下取出其淚腺，用PBS平衡溶液洗滌3次后，將其置于儲備溶液中，剝離其上的血管和纖維結締組織。將漂洗后的淚腺分為3塊（1-2 mm×1-2 mm/塊）?；旌闲迈r制備的2 g·L-1II型膠原酶，并在37℃下孵育25分鐘。離心后的淚腺上皮細胞貼壁純化，在含有5%的CO2培養箱中于37℃培養。36小時和2天后，分別更換半量和全量的溶液，然后每4天更換一次液體。后每隔10天進行一次傳代。將第三代細胞用于實驗。

1.4 淫羊藿總黃酮含藥血漿的制備

將60只雄兔隨機分為4個淫羊藿總黃酮組：10倍、5倍、2.5倍劑量組和空白組。根據體表面積轉換的方法，計算每只兔子的藥物量（兔的藥物量=人的藥物量×70×0.07），其中人的藥物量為26 mg/kg，故兔子的藥物量為85.02 mg/kg，并給予空白組同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。各組灌胃一周后，以空氣栓塞法處死兔，立即心臟穿刺抽取動脈血置入離心管，并與3.8%枸櫞酸鈉溶液(枸櫞酸鈉∶血=1∶9)顛倒混勻。離心后提取上清液。-80°C下0.45μm手動負壓過濾器過濾分配和儲備。

1.5 探討添加含藥血漿的量（MTT細胞毒性試驗）

將培養好的第三代淚腺上皮細胞用DMEM/F12配置成細胞懸液（100×103個/mL），96孔板中每孔種90μL，待細胞貼壁后，加入不同濃度的含藥血漿，每孔總體積為200μL，培養24小時后，去除培養基，加入含有10μL MTT（5 mg/mL）的無血清培養基，在細胞培養箱中繼續培養約4 h。4 h后去除培養基，每孔加入150μLDMSO，搖晃均勻5分鐘，微量板讀數儀在490 nm波長測定每孔吸光值（OD值）。計算每組空白血漿中細胞的抑制率：抑制率=1-實驗組OD值/對照組OD值。以50%抑制率的濃度作為選擇濃度。通過公式計算各組抑制率。公式為：LgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4），其中Xm∶Lg最大劑量，I∶Lg（最大劑量/相臨劑量），P：抑制率之和，Pm：最大抑制率，Pn：最小抑制率。

1.6 細胞模型的建立和含藥物血漿的干預

將淚腺上皮細胞培養在（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 ug/mL鏈霉素）DMEM/F12培養基中，置于37℃含5%CO2的細胞培養箱中。當細胞長至80%～90%時，去除培養基，加入PBS洗1～2次。去除PBS后，再加入1 mL胰酶進行消化，1-3 min后加入3 mL完全培養基以中和胰酶而停止消化過程。將消化完成的細胞轉移至15 mL離心管中，1000 rpm離心5分鐘。去除上清液，加入3 mL培養基重懸細胞，1:3傳代至培養皿中培養。將長到培養皿80%～90%的淚腺上皮細胞用胰酶消化下來，1000 rpm離心后去除上清，加入完全培養基重懸細胞，將細胞種在6孔板中（每孔1×106個細胞）。細胞融合后2小時，將培養的細胞隨機分為淫羊藿總黃酮、雄激素組和空白組，各組加入不同的培養基內培育48小時。淫羊藿總黃酮組培育于含有淫羊藿總黃酮和15%胎牛血清的DMEM/F12低葡萄糖培養基。雄激素組培育于含有1×106moL/L丙酸睪酮和15%胎牛血清的DMEM/F12低葡萄糖培養基。空白組培育于空白血漿和15%胎牛血清的DMEM/F12低葡萄糖培養基。

1.7 RT-PCR技術測定含藥血漿對Foxp3表達的影響

1.7.1 RNA提取

樣品處理：將培養完成的細胞置于100μmol/L的過氧化氫中誘導細胞凋亡，60分鐘后去除培養基，PBS洗細胞。除去PBS，加入1 mL trizol，室溫下2分鐘后，將其轉移到不含RNA酶的EP管中。放200 uL氯仿后用力搖晃15秒。相分離：室溫靜置15分鐘。離心后轉移上清液進新的EP管。RNA沉淀：加入同一量的異丙醇混合后離心。RNA洗滌：除去上清液后混合1 mL 75%乙醇，將混合物振蕩15秒，然后離心。RNA溶解：除去上清液，靜置3～5分鐘。溶解于50μL DEPC水，nanodrop檢測濃度，保存于-80℃冰箱。

1.7.2 逆轉錄

去除基因組DNA：在冰上進行反應液的配制（6μL RNA、1μL DNA污染清除試劑、2μL DNA污染清除緩沖液、1μL DEPC水）然后放置于室溫，反應10分鐘。逆轉錄PCR反應：將10μL第一步反應液、4μL反應緩沖液5×Primescript Buffer、1μL反轉錄酶5×Primescript RT Enzyme Mix、4μL反轉錄隨機引物RT Primer Mix、1μL DEPC水混合后，在PCR儀器中進行逆轉錄（37℃，15分鐘，85℃，5秒）。

1.7.3 熒光定量PCR

整個試劑配制體系在冰上配制：10μL SYBR Green solution、7.2μL滅菌雙蒸水、2μL cDNA、0.4μL PCR上游引物（10μM）、0.4μL PCR下游引物（10μM）。SYBR green是混勻好的試劑，里面有Taq polymerase，dNTP，Sybrgreen染液，反應緩沖液。輕輕混勻試劑后，使粘附在壁上的液體離心到底層。使用上述反應系統將8個管置于定量PCR測定中。PCR反應結束后，直接將8連管丟棄，直接根據儀器收集的數值對數據進行分析即可。

1.7.4 RT-PCR實驗

RT-PCR法檢測采用染料法（SYBR Green I），按照ΔΔCt解析法來進行設計，對Foxp3mRNA行相對定量分析：明確對照樣本與處理樣本及所有樣本的目的基因及其持家基因的Ct值；求出ΔCt=Ct未知-Ct持家基因，ΔΔCt=ΔCt未知-ΔCt對照；求相對含量，即相對含量=2-△△Ct。

1.7.5 統計學分析

圖1 原代細胞

圖2 第二代細胞

圖3 第一代細胞

本研究的實驗數據通過SPSS23.0統計軟件處理，計量資料以(xˉ±s)表示。單因素方差分析用于組間比較，t檢驗用于比較之前和之后。計量資料通過χ2檢驗進行分析，P＜0.01被認為具有統計學意義且差異顯著。

2 結果

2.1 淚腺上皮細胞培養

在顯微鏡下可見原代細胞胞膜清亮。第一代細胞部分附著在培養表面，部分偽足突出。第二代細胞胞體肥大透明，胞膜清楚，中央可見細胞核，生長活躍。第三代細胞看到細胞全部粘附、伸長，可單層融合。各代細胞見圖1～圖4。

2.2 含藥血漿加入量的確定

圖4 第三代細胞

圖5 每組中GAPDH的擴增曲線圖

圖6 每組中GAPDH的溶解曲線圖

淫羊藿總黃酮10倍、5倍、2.5倍劑量組和空白組細胞抑制率分別為(0.08±0.09)%、(0.09±0.06)%、(0.05±0.06)%、(0.02±0.06)%，因此，選擇2.5倍組作為選擇的目標濃度。

2.3 GAPDH在不同樣本中的數據分析

從圖像中可以看出，每組中的GAPDH擴增效果令人滿意，并且樣品的逆轉錄是順利的。GAPDH的擴增曲線和每組的擴增后融解曲線的分析見于圖5和圖6中。

2.4 Foxp3mRNA表達量分析

Foxp3mRNA表達相對含量（2-ΔΔCt）見表2。每組中的Foxp3mRNA擴增曲線和融解曲線分析見于圖7和圖8中。淫羊藿總黃酮組Foxp3mRNA的含明顯高于雄激素組和空白組(P＜0.01)；雄激素組Foxp3mRNA的含量明顯高于空白組(P＜0.01)；空白組Foxp3mRNA的含量顯著低于總黃酮和雄激素組(P＜0.01)。

表2 每組Foxp3mRNA表達相對含量（2-△△Ct）

圖7 每組中Foxp3mRNA的擴增曲線

圖8 每組中Foxp3mRNA的溶解曲線

3 討論

干眼癥的發病率在全球范圍內逐年上漲，在中國目前約21%～30%[4-5]。在對其50余年的研究中發現，人眼本身具有免疫赦免的特性，而這種赦免一旦被打破，免疫性眼病發生的風險就隨之提高[6]，而干眼癥正是這樣一個因免疫紊亂而介導的眼表疾病。在國際淚膜和眼表協會（the Tear Film&Ocular Surface Society，TFOS）干眼疾病工作組第二次會議（TDOS Dry Eye WORKshopⅡ，TFOSDEWSⅡ）中指出，干眼的危險因素包含了結締組織病、干燥綜合征等免疫系統疾病，并且提到使用激素及免疫抑制劑是應對干眼的一個治療措施[7]，也再次證實了干眼與免疫應答機制失衡之間有著密不可分的緊密聯系。調節性T細胞在眼表免疫應答的發展和進展中舉足輕重，很多血清學或細胞水平的研究都證實T細胞在自身免疫性疾病中都有異常改變[8]。調節性T細胞是一類可調節免疫細胞增殖、分化與功能，占維持機體免疫穩態和免疫耐受的外周CD4+T淋巴細胞亞群的5%～10%，其在諸如自身免疫疾病、腫瘤、器官移植和慢性感染等疾病中起重要作用。根據其發育分化、抗原特異性與效應機制的不同，可將其分為產生自胸腺的胸腺源性Treg細胞，由初始T細胞在外周組織中或體外誘導分化而來的表達Foxp3（forkhead box p3）的誘導性Treg細胞。除控制自身反應性T細胞的激活和增殖外，Treg細胞還涉及各種免疫抑制功能的控制[9]。Foxp3作為Treg分化發育的特異性核轉錄因子，是本研究通常所說的Foxp3+Treg譜系發育、表型和功能的決定基因[10-11]，其對于自身免疫疾病等炎癥性疾病的發生，發展和易感性至關重要。Foxp3通過多種途徑實現免疫抑制作用，包括了誘導抑制性細胞因子產生的途徑、調節抗原遞呈細胞功能的途徑、免疫介導細胞凋亡的途徑、干擾細胞代謝的途徑，最后通過轉錄水平和蛋白質的翻譯后調控實現細胞功能的管理[12]。轉錄因子Foxp3因其蛋白表達、轉錄復合體動態組裝及其穩定性，可反映Treg的活性水平，被認為是調節性T細胞的標志分子，其在調節性T細胞的發育，分化和維持中起重要作用[13-19]。當調節性T細胞丟失或改變其Foxp3表達時，其引起調節性T細胞的數量和功能的異常，就無法發揮其免疫負性調節作用[20]，導致免疫紊亂和自身免疫疾病的發生[21]。在對諸多免疫相關疾病，如哮喘、過敏性鼻炎、銀屑病、類風濕性關節炎等疾病的研究中心都發現了Foxp3的低表達，這可能與人類染色體上Foxp3蛋白編碼基因突變導致的Foxp3+Treg功能紊亂有關。因此，干眼作為一個免疫相關性眼病，其與Foxp3的表達之間有著密不可分的關系。

目前，中藥調節免疫的作用治療干眼癥是一個研究的熱點，因其具有安全、有效、廉價的優勢，受到廣大中醫工作者及患者的青睞[22]。臨床上常規使用復方治療干眼癥，而近年來對單味藥治療干眼癥的研究愈加深入[23]。早在《本草綱目》中就有對淫羊藿的記載，曰：“淫羊藿味甘氣香，性溫不寒，能益精氣……真陽不足者宜之”。淫羊藿亦名仙靈脾、放杖草、棄杖草、千兩金、干雞筋、黃連祖、三枝九葉草、剛草，性味辛、寒、無毒，在眼科上可用于治療日昏生翳、病后青盲、小兒雀目、痘疹入目等眼病。干眼癥在中醫眼科上屬于“白澀病”的范圍，又稱“干澀昏癥”及“神水將枯癥”“神氣枯瘁”。眼的干燥為干澀不通之疾。五臟正常功能受“燥”所傷，必會導致肺、肝、腎之功能失調，精血陰液不足，潤澤目珠之津精化生不足，目珠失于潤澤而致干眼癥的發生。而淫羊藿作為一味能夠益精氣、補真陽的補陽藥，通過補肺、肝、腎的陽氣，從而推動氣的生成和運化，氣行則津液自能運化和生成，眼球則得以潤澤。從現代藥理學的研究進展上來看，淫羊藿總黃酮因其具有的對機體雙向調節免疫功能[24]而廣泛地取得了科研工作者的關注和。黃酮類化合物廣泛存在于植物的根、葉、花和種子等不同部位中，淫羊藿則是這樣一種全草供藥用的植物。黃酮類化合物被認為在抗炎，抗菌，抗病毒，抗腫瘤和抗氧化中起重要作用，但是近年來，黃酮類化合物因其增強NK細胞和細胞毒性T細胞的殺傷活性以及細胞因子的釋放的強大作用被認為是天然且高效的免疫調節劑[25]，其可以提高抗體效價[26]和免疫器官指數，增強黏膜免疫[27]，改善機體免疫系統。黃酮類化合物主要通過介導T細胞及NK細胞等免疫細胞信號通路調控相關免疫分子、基因和蛋白質表達來實現對免疫細胞的調控。黃芪桂枝五物湯總黃酮就被真是能夠顯著提高小鼠T淋巴細胞的細胞毒活性及水平來增強細胞免疫[28]。淫羊藿總黃酮是淫羊藿的主要有效成分[29]，同樣主要活性成分為黃酮類物質的淫羊藿也被大量文獻證實可協同調節T細胞，抑制淋巴細胞凋亡和壞死[30]。其重塑T淋巴細胞凋亡相關基因平衡的作用，與本研究調節干眼眼表免疫環境穩定性的目的不謀而合，為淫羊藿總黃酮治療干眼癥的可行性提供了依據。

目前，針對不同類型不同程度的干眼，都有各種不同的治療方案，但是都有其弊端及不足。針對淚液分泌不足型的干眼癥，輕者可以通過補充人工淚液或使用促淚液分泌劑來緩解，但是人工淚液需常年使用，且并不能從根本上解決眼干本質。促淚液分泌劑大部分都是膽堿能受體激動劑，最常見的副作用就是多汗、頭痛、惡心、嘔吐等。在治療依然無效的情況下則需要使用淚點栓塞的方法，但是溢淚、化膿性肉芽腫、淚小管炎、淚囊炎等并發癥的風險及對手術的畏懼心理讓很多患者止步。針對蒸發過強型的病人，瞼板腺按摩是首選，但是視頻終端使用的不可避免、年齡的增長、糖尿病等內科疾病的并發癥會導致治療的效果維持時間很短，甚至是效果不佳。對于嚴重的干眼病人局部使用抗生素或非甾體抗炎藥療效可觀，但是副作用也不容忽視。非甾體抗炎藥本身可以引起角膜敏感性下降，影響角膜上皮損害修復，激素使用后會出現眼壓升高、后囊型白內障的形成，且這些藥物均含有防腐劑，可加速干眼癥形成。因此作為一個中醫的追隨者，發揚中醫中藥的獨特優勢，尋找一個安全、有效、可推廣的中醫藥治療方法和中草藥免疫抑制藥物迫在眉睫。

本實驗通過對干眼癥淚腺上皮細胞凋亡模型含藥血漿干預后，定量PCR檢測淚腺組織中Foxp3mRNA的陽性表達。淫羊藿總黃酮血漿組中Foxp3mRNA的含量明顯增加，與其他組有顯著差異(P＜0.01)。研究結果表明，淫羊藿總黃酮可以增加淚腺組織中Foxp3mRNA的含量，相比雄激素有著顯著差異。

本研究的結果表明，淫羊藿總黃酮含藥血漿可以促進Foxp3mRNA含量的途徑而減少細胞凋亡。但是調控眼表免疫反應的通路諸多，也伴隨著相關因子表達量的變化[31]。Foxp3作為一個免疫相關因子，能一定程度上體現細胞凋亡的水平，但是并不全面。在未來的相關研究中期待可以從調節性T細胞、細胞毒性T細胞和輔助性T細胞等多個因子方面，綜合觀察免疫對其表達的影響，以更全面地評估含藥血漿對細胞凋亡的抑制作用。淫羊藿總黃酮是一種天然藥物，資源豐富，分離提純工藝成熟，且其療效肯定[32]，可能成為一種新的具有免疫抑制作用的中藥，以避免激素、免疫抑制劑等所造成的副作用、起效慢等缺點[33]。但其最佳有效使用劑型及用法、用量等，值得更大樣本、大數據的研究。