復(fù)合促生菌株篩選及其對(duì)油菜、黃瓜幼苗的促生效果

張 亮，盛 浩，譚 麗，袁 紅，易建平，鄧立平

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.醴陵市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局土壤肥料工作站，湖南 醴陵 412200；3.醴陵市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 醴陵 412200；4.醴陵市農(nóng)技推廣中心，湖南 醴陵 412200）

化肥和農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，然而隨著化肥與農(nóng)藥使用量的逐年增加，其殘留物對(duì)環(huán)境造成了巨大危害。在提倡高產(chǎn)、高效、綠色農(nóng)業(yè)的大背景下，高效、復(fù)合型促生菌的研究與應(yīng)用為尋求傳統(tǒng)化肥、農(nóng)藥替代產(chǎn)品以及修復(fù)受損土壤環(huán)境指明了方向。根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）泛指一類自由生長(zhǎng)在根際土壤環(huán)境中或根系內(nèi)部，并具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)或增加作物產(chǎn)量、抑制病蟲害能力的根際細(xì)菌，其對(duì)克服土壤逆境、改善微生態(tài)環(huán)境具有特殊意義[1]。目前為止，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有防病促生潛能的根際微生物有20多個(gè)種屬，包括根瘤菌、沙雷氏屬、熒光假單孢菌、芽孢桿菌等[2]。上述根際促生菌對(duì)于植物的促生機(jī)制主要包括合成對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育有直接促進(jìn)作用的物質(zhì)[如吲哚乙酸（IAA）等植物激素]、改變?cè)匦螒B(tài)促進(jìn)植物對(duì)于養(yǎng)分的吸收等（如固氮、解磷）[2-8]；然而，大多數(shù)菌株在克服養(yǎng)分、病害逆境時(shí)功能較為單一；因此，篩選獲得具有復(fù)合能力的促生菌株，對(duì)高效改善根際營(yíng)養(yǎng)與調(diào)控土壤微生態(tài)環(huán)境具有非常重要的意義。

油菜（Brassica napusL.）和黃瓜（Cucumis sativusL.）均為我國(guó)大面積種植作物，特別是油菜，因其花期之前可作菜用，花期之后籽粒可榨油而具有“油—菜兼顧”之特色，在我國(guó)蔬菜和食用油領(lǐng)域占有重要地位[9]。本研究以稻—油不同輪作條件下的耕層土壤為樣本，擬通過(guò)選擇性培養(yǎng)方法獲得兼具固氮、解磷以及產(chǎn)IAA能力的復(fù)合型高效促生菌株，并通過(guò)盆栽試驗(yàn)對(duì)其促生效果予以驗(yàn)證。本研究不僅能夠?yàn)槭卟朔N植養(yǎng)分培育資源的更廣闊替代利用提供優(yōu)良促生菌株材料，還可以從可培養(yǎng)耕層土壤促生菌數(shù)量的角度揭示稻—油輪作制度對(duì)地力生態(tài)功能維護(hù)的優(yōu)勢(shì)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試土壤與種子

土壤為稻—油輪作與稻—稻輪作耕層土壤，位于湖南瀏陽(yáng)的農(nóng)大稻—油輪作試驗(yàn)田。

油菜品種為常雜油菜3號(hào)，購(gòu)于湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院湘科種苗集團(tuán)。黃瓜品種為蔬研十號(hào)，購(gòu)于湖南興蔬種業(yè)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

肉湯酵母培養(yǎng)基（NBY）：營(yíng)養(yǎng)肉湯粉8 g，酵母提取物2 g，磷酸氫二鉀2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，葡萄糖2.5 g，1 mol/L七水合硫酸鎂1 mL，去離子水1 L，瓊脂15 g，pH值7.5。

固氮培養(yǎng)基（阿須貝培養(yǎng)基+無(wú)N培養(yǎng)基）：蘋果酸2 g，三水合磷酸氫二鉀0.5 g，七水合硫酸鎂0.2 g，氯化鈉0.1 g，二水合氯化鈣20 mg，鉬酸鈉2 mg，氫氧化鉀4.5 g，5%溴百里酚5 mL，維生素H 10 mg，瓊脂15 g，去離子水1 L，pH值7.5。

解磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，磷酸鈣5 g，六水合氯化鎂5 g，七水合硫酸鎂0.25 g，氯化鉀0.2 g，硫酸銨0.1 g，瓊脂15 g，去離子水1 L，pH值7.0。

液體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，去離子水950 mL，pH值7.0。

IAA檢測(cè)培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g，植物蛋白胨3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鉀2.5 g，葡萄糖2.5 g，色氨酸100 μg/mL，最終pH值7.3±0.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合促生菌株篩選試驗(yàn)

土壤可培養(yǎng)細(xì)菌分離采用連續(xù)稀釋法，具體步驟為：稱取10 g土壤于置有90 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，振蕩搖勻30 min（180 r/min），靜置5 min，分別吸取1 mL懸液加入置有9 mL無(wú)菌水的滅菌試管中，后依次連續(xù)稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同濃度，吸取不同濃度混合液100 μL并涂布于NBY培養(yǎng)皿中，于25 ℃條件倒置培養(yǎng)于生化培養(yǎng)箱中。

菌株純化：每隔12 h觀察上述培養(yǎng)皿生長(zhǎng)情況，待菌落生長(zhǎng)至適合形態(tài)時(shí)，用接種棒挑取單菌落劃線至NBY培養(yǎng)皿，25 ℃條件倒置培養(yǎng)于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，備用。

促生菌初篩：分別將純化后的菌株接種于固氮、解磷培養(yǎng)基，室溫條件培養(yǎng)，每隔12 h觀察菌株生長(zhǎng)情況，在2種固氮培養(yǎng)皿上同時(shí)可以良好生長(zhǎng)的菌株記為固氮菌，在解磷培養(yǎng)基上可觀察到清澈透明圈的菌株記為解磷菌，所有記號(hào)菌株均另劃線接種至新NBY培養(yǎng)皿、編號(hào)、室溫培養(yǎng)3 d，后轉(zhuǎn)至4 ℃低溫保存，備用。

促生菌復(fù)篩：將疑似菌株重復(fù)進(jìn)行固氮解磷培養(yǎng)試驗(yàn)，以檢驗(yàn)效果是否準(zhǔn)確，同時(shí)將疑似固氮解磷菌株分別接種至含有5 mL液體LB培養(yǎng)基的10 mL試管中，于170 r/min，28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，后加入Salkowsky生長(zhǎng)素顯色試劑，觀察顯色反應(yīng)，確定其產(chǎn)IAA能力強(qiáng)弱，如顯粉紅色則為產(chǎn)生長(zhǎng)素菌株，記號(hào)并進(jìn)行生長(zhǎng)素定量檢測(cè)。

IAA定量檢測(cè)[10]：接種于IAA檢測(cè)培養(yǎng)基的各生防菌株在24 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，經(jīng)12 000 r/min離心10 min，1 mL菌懸液加入2 mL Salkowsky試劑并混勻，于28 ℃培養(yǎng)30 min后得到粉色顯色，并在530 nm條件下進(jìn)行比色，以10～100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)IAA稀釋液設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，單位表示為μg/mL。

1.2.2 盆栽促生試驗(yàn)

采用人工氣候箱培育油菜和黃瓜幼苗，具體步驟為：（1）土壤（過(guò)2 mm篩風(fēng)干土）裝杯；（2）供試促生菌經(jīng)純化后接種于100 mL NBY液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)48 h，備用；（3）將形態(tài)一致的油菜種子、黃瓜種子分別于各菌株發(fā)酵液中浸種10 min，后均勻播種于上述土杯中（每杯5粒），并將剩余菌液倒入各處理土壤，以清水作為對(duì)照；（4）培養(yǎng)于人工氣候箱中。培養(yǎng)條件：28 ℃光照16 h+16 ℃無(wú)光8 h。

試驗(yàn)設(shè)無(wú)菌對(duì)照處理和已篩選出的不同復(fù)合菌株處理，各處理重復(fù)10杯，日常管理。10 d后觀察記錄不同處理油菜、黃瓜幼苗植株鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)、株高等生長(zhǎng)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮、解磷菌株初篩結(jié)果

從表1可以得出，篩選并純化處理后，最終獲得稻—稻輪作土壤中可分離菌株194株，稻—油輪作土壤中可分離菌株208株。

通過(guò)選擇性培養(yǎng)基專性生長(zhǎng)培養(yǎng)法，初步篩選共獲得固氮菌73株，其中稻—稻輪作土壤獲得35株，稻—油輪作土壤獲得38株；解磷菌38株，其中稻—稻輪作土壤獲得3株，稻—油輪作土壤獲得35株（表1）。

表1 固氮、解磷菌株篩選結(jié)果 株

2.2 固氮、解磷菌株復(fù)篩驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)比2種不同種植制度中所獲解磷菌與固氮菌編號(hào)（圖1、圖2）發(fā)現(xiàn)，同時(shí)兼具解磷與固氮效果的復(fù)合菌株編號(hào)為：59、69、79號(hào)（稻—稻）；6、7、14、107、110、111、112號(hào)（稻—油）。

2.3 復(fù)合型固氮解磷菌產(chǎn)IAA能力定量檢測(cè)

通過(guò)對(duì)兼具固氮與解磷特性的復(fù)合菌株進(jìn)行產(chǎn)IAA能力定量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，DD-69、DD-79、DY-6、DY-7、DY-111、DY-112具有較強(qiáng)的IAA分泌能力（＞10 μg/mL），其濃度范圍為10.09～12.59 μg/mL（表2）。

2.4 盆栽促生實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

如表3所示，與對(duì)照相比，篩選出的6株復(fù)合型促生菌對(duì)油菜和黃瓜幼苗早期株高的生長(zhǎng)普遍具有顯著的促進(jìn)效果，其增幅分別為25.45%～111.96%和4.45%～18.22%，以DD-69最佳；促生菌DY-6與DY-7菌株對(duì)油菜幼苗早期根系生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)效果，DD-79、DY-111菌促生效果均不顯著；促生菌DD-69與DY-111對(duì)黃瓜幼苗早期根系生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)效果，且與CK和其他菌株差異顯著；促生菌對(duì)油菜幼苗早期鮮質(zhì)量的影響差異不顯著，但促生菌DY-6和DD-79對(duì)黃瓜幼苗早期鮮質(zhì)量具有顯著促生效果。

表2 產(chǎn)IAA能力檢測(cè)結(jié)果（部分菌株）

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)選擇性培養(yǎng)基分離等傳統(tǒng)微生物技術(shù)對(duì)稻—稻輪作與稻—油輪作制度下耕層水稻土壤中的促生細(xì)菌進(jìn)行了分離與篩選工作，結(jié)果表明稻—稻輪作耕層土壤中分離獲得194個(gè)菌株，其中含固氮菌35株、解磷菌3株；稻—油輪作耕層土壤中分離獲得208個(gè)菌株，其中含固氮菌38株、解磷菌35株。復(fù)合驗(yàn)證結(jié)果顯示，兼具固氮、解磷以及較強(qiáng)生長(zhǎng)素分泌能力的促生菌株共6株，分別為DD-69、DD-79、DY-6、DY-7、DY-111、DY-112，其IAA分泌濃度為10.09～12.59 μg/mL。經(jīng)人工氣候箱培育試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，獲得的6株復(fù)合型促生菌普遍對(duì)油菜和黃瓜早期幼苗株高生長(zhǎng)具有一定的促生效果，尤其是有利于幼苗株高的生長(zhǎng)。

根際促生菌（PGPR）是一類根際環(huán)境友好型微生物，具有改善土壤理化性質(zhì)、提高土壤肥力、抑制病蟲害發(fā)生等重要農(nóng)業(yè)利用屬性[11]。對(duì)復(fù)合型高效促生菌的篩選是獲得這類有益微生物的必然途徑。本研究以稻—稻、稻—油等不同輪作制度的耕層水稻土壤為篩選材料，通過(guò)傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)，對(duì)其中的固氮菌、解磷菌以及生長(zhǎng)素代謝菌等可培養(yǎng)功能細(xì)菌進(jìn)行了分離與篩選，并經(jīng)復(fù)篩與盆栽試驗(yàn)對(duì)獲得的6株復(fù)合型促生菌株的促生效果予以了明確。這與前人[11]有關(guān)固氮、解磷菌促進(jìn)作物生長(zhǎng)的試驗(yàn)結(jié)果一致。本研究中6株促生菌雖對(duì)油菜幼苗和黃瓜幼苗的早期生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)效果，但對(duì)根系的促生效果普遍不夠顯著（DD-69和DY-111除外），這可能與接種劑量以及容重等土壤理化性狀有關(guān)[12]。此外，本研究結(jié)果還顯示出稻—油輪作制度下耕層水稻土壤中的可分離細(xì)菌以及具有固氮、解磷、產(chǎn)IAA能力促生菌可篩選數(shù)量明顯高于稻—稻輪作制度的種植土壤，從根際有益微生物的角度佐證了稻—油輪作制度對(duì)作物根際土壤生態(tài)環(huán)境的積極作用。

表3 促生菌對(duì)油菜、黃瓜幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)效果