大黃魚REL 基因在鰻弧菌侵染后的表達變化分析

劉 剛，江麗華，王露萍

(國家海洋設施養殖工程技術研究中心,浙江舟山 316022)

大黃魚Larimichthys crocea 屬鱸形目Perciformes、石首魚科Sciaenidae，是福建、浙江一帶重要的經濟魚類，也是我國重要的海水養殖品種，被農業部確定為6 種最具優勢的出口水產品之一[1]。自上世紀90 年代以來，大黃魚養殖產業蓬勃發展，然而，隨著大黃魚養殖規模的擴大，各種細菌性疾病發生也日益頻繁，嚴重制約著大黃魚養殖業的健康發展，其中由弧菌Vibrio alginolyticus 引起的弧菌病是養殖大黃魚最常見的傳染性疾病之一，流行范圍廣、危害最為嚴重，發病率和死亡率高，給大黃魚養殖業帶來嚴重的經濟損失[2]。其中，鰻弧菌是感染大黃魚的主要病原菌之一。

NF-kB 蛋白家族是一類重要的轉錄因子，能夠參與到多種生命活動中，如免疫應答、細胞調亡、信號通路傳導以及細胞的發育等。在脊椎動物中，NF-kB 蛋白家族存在5 個成員：RELA、RELB、REL、NF-KB1和NF-kB2。所有的NF-kB 蛋白家族成員都包含一個保守的RHD 結構域，RHD 結構域能夠使不同成員間形成同源二聚體或異源二聚體[3]。

NF-kB 作為一種轉錄復合物，對宿主防御至關重要，其介導物為先天和適應性免疫[4]。NF-kB 參與調控眾多編碼蛋白的基因，這些蛋白涉及免疫功能、炎癥或細胞生長控制，是典型的50 kDa 亞基(p50)和65 kDa (p65)亞基的異質二聚體[5]，并且在單核細胞因子表達調控中發揮重要作用。

作為NF-kB 家族成員，REL 可參與維持B 細胞生存[6]、促進T[7]、B[8]細胞增殖和調節T 與B 細胞功能。作為轉錄因子，REL 基因通過多種靶基因起調節作用。REL 基因同其家族一樣，同樣包括了RHD 結構域和TAD 結構域，但并不含有ANK 重復結構域。

有關海水養殖動物轉錄因子的研究,自2004 年在牡蠣Ostrearum 中鑒定了第一個REL/NF-kB 類似物基因以來[9]，相繼在九孔鮑Haliotis diversicolor sypertext[10]和珠母貝Pinctada fucata[11]中報道了REL/NFkB 家族成員的存在，并證實了它們在其免疫反應中起著重要作用。大黃魚作為重要的海水養殖魚類，REL基因在大黃魚先天免疫系統的作用仍未見報道，本研究旨在揭示大黃魚REL 基因的特征，從而為了解大黃魚先天免疫系統提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及鰻弧菌侵染實驗

實驗所用健康大黃魚100 尾(約200 g/尾)取自福建沙埕港養殖基地。活魚解剖并取腦、肌肉、心臟、鰓、腸、肝臟、脾臟和腎8 個組織，低溫運輸至實驗室并轉移到-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

鰻弧菌侵染實驗，采用1 齡大黃魚(500～700 g/尾) 共36 尾，健康無傷病，于循環水箱中暫養1 周以上，飼養期間投喂新鮮小雜魚。隨機平均分為對照組和實驗組2 組，每組18 尾。實驗組于腹腔內注射鰻弧菌200 μL(PBS 重懸，細胞數約為1.0×107個)，對照組注射PBS 200 μL。分別于注射后6，12，24，48，72 和96 h 采樣，每組每次隨機挑取3 尾，解剖取肝、脾和腎3 個組織，于液氮中速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于誘導后不同時間點的組織特異性表達分析實驗。

1.2 大黃魚REL 基因cDNA 序列分析

利用在線軟件(http://web.expasy.org/translate/)對REL 的氨基酸序列進行預測。通過Expasy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)測定理論分子量(MW)和等電點(pI)。利用在線工具TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)確定是否存在跨膜域。

利用在線工具SMART (http://smart.embl-heide lberg.de/)預測蛋白質的結構域。利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)對三級結構進行了預測。

同源性搜索使用NCBI 的BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch)程序和BLASTp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi? page=protein)進行。

利用ClustalW 對各相關物種進行多重序列比對，并使用ESPript3 (http://espript.ibcp)進行修飾(fr/ESPript/ESPript/index.php)。利用MEGA7 軟件鄰接法構建系統發育樹。

1.3 REL 基因的分子克隆

使用Trizol Total RNA Kit(Invitrogen，USA)按照說明從檢查的組織中分離RNA。通過UV-分光光度計(Eppendorf，Germany)測量RNA 濃度，并通過觀察18 s 和28 s 核糖體RNA 的強度，通過1%瓊脂糖凝膠分析RNA 的質量。然后按照說明書使用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，Japan)合成cDNA。使用Primer5.064 軟件設計PCR 引物，其根據來自大黃魚全基因組數據的REL 的CDS 序列設計。使用所需組織的cDNA 作為模板，使用熱循環儀(Bio-Rad，USA)在以下條件下進行PCR 擴增：50 ℃、2 min；95 ℃、30 s，然后40 個循環95 ℃、15 s，58 ℃、45 s，95 ℃、15 s，最后在72 ℃延伸5 min。

1.4 實時熒光定量PCR 并進行統計學分析

通過qPCR 確定REL 的組織特異性分布和一定時間內mRNA 表達。使用PrimeScriptTM RT 試劑盒(Tli RNaseH Plus，TaKaRa，中國)并按照說明，以20 μL 的終體積逆轉錄2 μg RNA 樣品。然后在含有0.8 μL引物-F(10 μmol·L-1)，0.8 μL 引物-R(10 μmol·L-1)，8II 的20 μL 反應混合物中進行熒光定量實驗。1 μL cDNA 樣品(100 ng·μL-1)，0.4 μL ROXII 和9 μL ddH2O(試劑濃度參見其制造商的說明書)一式三份。用引物β-actin-R 和β-actin-F 擴增的參考基因β-actin 來規范化REL 的表達。

所有數據采用Livak 和Schmittgen(2001)方法進行分析，得到相關的mRNA 表達量。將肌肉中的mRNA 表達作為對照，與各種組織進行比較，0～96 h 時間點構成對鰻弧菌感染挑戰的對照。采用SPSS Statistics 19 (IBM)進行t 檢驗，以確定實驗組與對照組之間觀察到的差異的統計學意義，以P<0.05 為具有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 REL 基因的特性描述

REL 基因由611 bp 核苷酸組成，編碼204 aa，預測的pI 為6.58，理論分子量為69.153 kDa。谷氨酰胺(9.0%)，天冬酰胺(8.5%)，脯氨酸和絲氨酸含量相同(7.7%)，這4 種是該肽鏈中發現的最豐富的氨基酸殘基。其帶負電荷的殘基(Asp+Glu)的總數為65，而帶正電荷的殘基(Arg+Glu)的總數為62。其次，Index 指數為46.60，表明不穩定。脂肪族指數為61.87，GRAVY 為-0.868。SignalP 4.1 online tool and THMM server未預測出REL 中有任何信號肽序列。

2.2 多重序列比對和系統進化樹分析

進行三維結構模型預測后，發現N 末端的DBD 在不同物種中是高度保守的，并且在所有IRF 中都發現了幾個保守氨基酸，包括多個色氨酸殘基。多重比對和氨基酸同一性比較表明，推導出的REL 的氨基酸序列與來自其他硬骨魚類物種的同源物具有高度同一性。在REL 基因中，第21～27 個氨基酸處具有其家族特征性序列：“FRYKCEG”，表明其高度保守，見圖1。

圖1 大黃魚與其它物種REL 基因氨基酸序列比對Fig.1 Comparison of amino acid sequences of REL gene between L.crocea and other species

使用來自多種脊椎動物的IRF 同源物的氨基酸序列構建系統發育樹，對比常見硬骨魚類。系統發育關系分析表明，大黃魚REL 基因的編碼蛋白序列同牙鲆Paralichtys olivaceus 具有一定相似性，但相似性較低，與其他物種更是差異明顯，見圖2。

圖2 基于REL 氨基酸序列構建系統進化樹(NJ 法)Fig.2 Building a phylogenetic tree based on REL amino acid sequences

2.3 鰻弧菌侵染前后，大黃魚REL 基因的組織表達

通過使用qPCR 分析來自未受鰻弧菌侵染的大黃魚的多種不同組織(對照組)來評估REL 的組織特異性分布，見圖3。

圖3 鰻弧菌侵染前qRT-PCR 檢測大黃魚REL 基因的組織表達Fig.3 Detection of REL gene expression in L.crocea by qRT-PCR before V.anguillarum infection

由圖3 看出，對照組中大黃魚腎、腦、鰓、肝、心臟、脾、肌肉以及腸中均有REL 基因表達，在三大組織脾、肝、腎中高表達，在腦、腸和心臟中呈中等表達，而鰓中低表達。

我們通過分析健康大黃魚中組織的基因表達，從魚體中收集脾、肝、腎組織，感染鰻弧菌后，在6，12，24，48，72 和96 h 時的組織表達變化，見圖4。

圖4 顯示，受鰻弧菌感染后，大黃魚REL 基因在0～24 h內，脾和腎表達量逐步升高，脾的表達量在24 h 左右到達其峰值，然后在24 h 以后快速回落。肝臟中，REL 基因在0～12 h內，表達量逐漸升高，12 h 后，表達量呈下降趨勢，逐漸降低。而腎臟中，REL 的表達量在0～24 h 內逐漸提高，24～48 h 內，表達量趨于穩定，48 h 后，表達量逐漸回落。

圖4 大黃魚脾、肝、腎組織受鰻弧菌感染后隨時間變化的表達量Fig.4 Expression of spleen,liver and kidney tissues of large yellow croaker with time after infection with Vibrio anguillarum

3 討論

隨著魚類養殖規模的擴大和養殖環境的惡化，近年來魚病防治形勢日趨嚴峻。魚類專家從魚體免疫機理著手，通過增強魚體抗病、抗逆能力來提高養殖產量和質量，其中細胞因子是研究熱點之一[12]。REL 基因是NF-kB 轉錄因子家族的成員，其n 端含有2 個c 端激活域，REL 家族成員的一個共同特征是含有1 個RHD 結構域，此結構域在不同物種之間高度保守，其功能是參與REL/NF-kB 蛋白與DNA 的結合以及蛋白的二聚體化[13]。RHD 也含有一個核定位信號，負責將蛋白從細胞質轉入細胞核內。

目前，REL 基因在人類和小鼠研究中有見報道，但在其他哺乳動物、鳥類和魚類等物種中研究案例較少。在人類研究中，REL 基因在b 細胞淋巴瘤中被擴增或突變，包括霍奇金淋巴瘤等。在多種細胞類型中，c-REL 以p50 的同二聚體或異二聚體的形式存在，很少與RELA 一起存在。含有c-REL 的二聚體與一組相關的9～10 bp DNA 序列(kB 位點)結合，調控眾多細胞基因的表達，包括許多涉及淋巴細胞發育、增殖和生存的基因。雖然跨物種的c-REL 蛋白的REL 同源域序列具有高度保守性，但其c 端激活域并不保守。因此，不同物種間c-REL 蛋白的DNA 結合特異性可能非常相似，但其失活區域的性質和調控可能會有所不同[14]。對小鼠中的REL 基因研究案例較少，張輝等[15]成功構建了小鼠RelA 基因的RNA 干擾慢病毒載體，當小鼠成骨細胞RelA 基因表達被干擾，NF-kB 通路被抑制后,小鼠成骨細胞成骨相關基因ALP、OCN的表達明顯上升,成骨功能增強，同時成骨基因的表達明顯下降,其介導的破骨細胞骨吸收功能減弱。

除了人和小鼠之外，對REL 基因的報道還有中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis 以及草魚Ctenopharyngodon idella、文昌魚Branchiostoma lanceolaturm，還包括少量單細胞動物。

在中國明對蝦研究中，獲得的中國明對蝦REL 基因的cDNA 片段所推導的氨基酸序列含有一個完整的RHD 結構域[16]，這和我們在大黃魚及其他物種中推導出的相一致，都具有完整的RHD 結構域。經過聚類分析發現它與果蠅的親緣關系最近，而我們通過進化樹發現大黃魚除了與其同屬種外，同牙鲆親緣關系較為密切。淋巴器官是對蝦重要的免疫器官，受到弧菌感染后，對蝦的免疫器官出現明顯上調，而大黃魚有著較為完整的免疫器官，其先天免疫系統較為完善，肝臟和脾臟是其重要的防御器官。

王海舟[17]在草魚NF-kB 信號通路中發現草魚NF-kB 3 個亞基在進化中保守，且都與魚類的親緣性高。在受到Poly I:C 和LPS 刺激下，草魚各組織中的c-REL 基因表達水平上調，說明它們與草魚的抗病毒或抗菌的生理過程有關。

基因共線性與基因結構比較分析結果顯示文昌魚REL 基因與人類RELB 基因直系同源，與人類的RELA 和REL 基因是旁系同源關系。在文昌魚REL 蛋白中，未發現NLS 的存在，TAD 結構域不是很保守，這與大黃魚及其他物種是不同的。在進化的過程中，REL 亞家族基因的保守序列片段發生規律性的改變，并受到較強的純化選擇[3]。

實驗證明鰻弧菌侵染大黃魚后，主要組織都會引起應激反應，并進行不同程度的表達。而引起的免疫反應中，脾和肝臟表達變化幅度較大，推測二者可能是主要的參與器官。說明REL 基因在大黃魚體內可能參與其他先天性免疫防疫系統的協同過程。大黃魚免疫基因信息的充分解析有利于為我國大黃魚基因組學研究提供理論支撐，有助于發現與抗病害相關的免疫基因位點，通過對這些免疫基因位點優良等位基因的聚合和選育，培育出先天免疫能力強、抗病力高的大黃魚抗病品系。

4 結論

本文獲得了長度為611 bp 的大黃魚REL 基因cDNA 序列，共編碼204 個氨基酸，未發現其信號肽序列。氨基酸序列多重比對表明大黃魚REL 基因具有該家族特征性序列，而進化樹關系顯示，大黃魚REL基因的編碼蛋白序列同牙鲆親緣關系較近。熒光定量PCR 檢測結果顯示健康大黃魚REL 基因在肝、腦和鰓中高表達，脾中少量表達。經鰻弧菌感染后，脾和肝中的REL 基因表達量差異顯著，應激明顯，提示大黃魚REL 基因表達與病原菌感染密切相關，并在免疫系統中扮演了一定的角色，為研究NF-kB 家族基因在其他魚類中的作用提供了基礎資料，為進一步了解硬骨魚種的先天免疫系統提供了理論依據，并為提高海水養殖大黃魚的抗病能力提供基礎資料。