長期低鹽脅迫對梭魚生長及生理的影響

張鼎元，柴學軍，阮澤超，張 燕，王躍斌

(浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316021)

鹽度作為水環境重要的理化因子，其變化對魚類的胚胎孵化率、仔稚魚的存活率、幼魚及成魚的生長發育等整個生命周期均有重要影響[1]。魚類所處環境水體鹽度偏離滲透壓時，其耗氧率、排氨率會因偏離程度的增大而增加，代謝能隨之升高，進而影響能量收支[2]。故在獲取同等能量的前提下，魚類生活在等滲點附近鹽度的水體中，可以節省調節離子和滲透調節所消耗的能量來用于生長，也因此許多廣鹽性魚類有生長率較高的鹽度范圍[3]。

當生境鹽度發生變化時，魚體的應激反應分為初級階段機體神經水平上的響應以及與其它滲透調節激素間的共同作用，包括魚體內的生長激素(growth hormone，GH)、皮質醇(cortisol，COR)、催乳素(prolactin，PRL)、鈉鉀泵(NKA)[4-5]。另外，魚類超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)的活性受到外在鹽度變化的影響[6]，研究魚類的滲透生理以及非特異性免疫酶類對低鹽脅迫的響應對于提高養殖效果具有顯著的意義。

梭魚Liza haematocheila，又稱西魚、赤眼鯔、黃鯔、紅目鰱、紅目呆。分類上屬于輻鰭魚綱、鯔形目、鯔科、梭魚屬。食性以植、腐食性為主，是我國北方重要傳統養殖魚類，也是沿海咸淡水養殖魚類中的主要種類[7]。梭魚廣鹽、廣溫，對鹽度的適應范圍為0～38，溫度適應范圍為0.7～35 ℃。梭魚具海鮮風味，營養豐富，俗稱“肉滾子”，通體僅1 根主刺且個體較大，具良好加工品質[8]。本試驗研究了不同鹽度對梭魚幼魚生長性能、滲透生理、非特異性免疫酶類及低鹽脅迫相關組織的影響，探討梭魚適應鹽度的生理機制，旨在為提高梭魚養殖水平提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗魚與試驗條件

本試驗于2019 年9 月至10 月在浙江省海洋水產研究所西軒漁業科技島內進行，實驗期間水溫19.2～22.1 ℃，試驗養殖水桶規格為200 L，試驗用梭魚為海捕個體。本試驗所用水桶和魚種放養前進行消毒處理，飼養期間若發生死魚情況，及時清理并進行無害化處理，以免傳染其他魚體。

1.2 試驗方法

將海捕梭魚幼魚暫養與室內水泥池內，每天早晚(08:30，16:00)投喂日本株式林兼會社虎豚商業飼料，投至飽食，喂食1 h 后用虹吸法將殘餌及糞便吸出，鹽度馴化期間正常投喂。暫養2 周后，挑選大小相近的梭魚540 尾平均分入18 個實驗桶內，魚體平均體重(8.78±1.67) g。

試驗設5 個組，這5 組的鹽度分別為0、5.0、10.0、15.0、25.0(對照)，每組設3 個平行。本試驗中，將鹽度于1 周內調節至各個目標濃度，低鹽度組用除氯自來水與沙濾海水配制而成。本試驗周期為6 周。

1.3 樣品采集與處理

每組抽取20 尾梭魚測量魚體質量，記錄飼料投喂量。實驗結束后，先測定實驗魚生長數據，再將其置于冰盤中，用1 mL 注射器于尾靜脈采血，4 ℃條件下以2 000 r·min-1低溫離心20 min，取上清液置于-70 ℃冰箱保存，待檢。

采集實驗魚左側和右側第2 鰓弓上的鰓絲、肝臟、脾臟，用生理鹽水潤洗，置于9 倍體積8 mg·mL-1的生理鹽水中，用勻漿儀進行冰浴勻漿，4 ℃下以1 000 r·min-1離心5 min，取上清液置于-30 ℃冰箱保存，待檢。

酶活性的測定：將鰓、肝、脾組織勻漿上清液加生理鹽水稀釋至5%后，采用康為世紀BCA 蛋白定量試劑盒測定組織蛋白濃度。將鰓組織勻漿上清液稀釋至2%測定NKA 活力；肝臟組織勻漿上清液稀釋至2%測定SOD 活力、至2.5%測定CAT 活力；MDA 含量的測定直接采用10%的肝臟組織勻漿上清液。AKP 的測定直接采用10%的脾臟組織勻漿上清液。以上各種酶活均采用南京建成生物生物工程研究所相關試劑盒進行測定

激素的測定：血清激素(GH，COR，PRL 等)的測定采用雙抗體一步夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)。原理為：血清中的激素(GH，COR，PRL 等)與其特異性抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體反應，后用底物四甲基聯苯胺(TMB)進行顯色反應。在450 nm 波長下測定吸光度，依據標曲計算激素濃度(ng·mL-1)。

1.4 數據處理

采用Excel 2003 軟件對試驗數據進行初步整理，再用SPSS 17.0 軟件對數據進行回歸分析和單因素方差分析。若影響顯著，則用Duncan’s 法進行多重比較，顯著性水平設為0.05。描述性統計值均以平均值±標準差(mean±S.D)表示。

2 結果

2.1 低鹽脅迫對梭魚生長及攝食的影響

由表1 可知：經過42 d 的低鹽脅迫處理后，只有0 鹽度組的成活率為98.89%，其余各鹽度組均為100%，這證明梭魚在低鹽脅迫下甚至淡水中均能成活。在0～42 d 內，S0、S5、S10 和S25(對照組)的特定生長率分別約為0.89%，1.05%，1.09%，1.03，均顯著低于S15 的1.16%(P<0.05)；5 個組的增重率及飼料系數也有相似的規律，均在S15 組最優，且顯著高于其他各組(P<0.05)。S5 鹽度組攝食率最低為1.65%，其余各組差異不顯著(P＞0.05)。

表1 低鹽脅迫下梭魚幼魚成活、生長及攝食情況Tab.1 Survival,growth and feeding of juvenile L.haematocheila under low salt stress

2.2 低鹽脅迫對梭魚幼魚滲透調節相關激素的影響

不同鹽度低鹽脅迫對下梭魚幼魚血清中GH 濃度的影響如圖1。結果顯示，隨著鹽度的上升，梭魚血清中GH 含量呈上升的趨勢。其中鹽度S0 組GH 含量最低為6.32 ng·mL-1(P<0.05)；而血清GH 含量在S25(對照組)中達到峰值8.51 ng·mL-1(P<0.05)。

圖1 低鹽脅迫對梭魚幼魚血清GH 濃度的影響Fig.1 Effect of low salt stress on serum GH concentration of L.haematocheila

不同鹽度低鹽脅迫對梭魚幼魚血清COR 濃度的影響如圖2。結果顯示，在本實驗采用的5 種鹽度條件下，梭魚血清中COR 濃度隨著鹽度升高呈現先下降后上升的趨勢，在鹽度為25 時達到最高值13.50 ng·mL-1，較最低的鹽度0 組高了28.57%，與其余各組差異顯著(P<0.05)。

圖2 低鹽脅迫對梭魚幼魚血清COR 濃度的影響Fig.2 Effect of low salt stress on serum COR concentration of L.haematocheila

根據圖3 可知，低鹽脅迫對下梭魚幼魚血清中PRL 濃度變化趨勢與GH 相反，隨著鹽度的升高其濃度隨之下降，在S25(對照組)中PRL 含量最低為0.74 ng·mL-1(P<0.05)，鹽度S5 組PRL 表達量最高為1.23 ng·mL-1(P<0.05)。

圖3 低鹽脅迫對梭魚幼魚血清PRL 濃度的影響Fig.3 Effect of low salt stress on serum PRL concentration of L.haematocheila

和PRL 變化趨勢類似，低鹽脅迫下梭魚幼魚鰓NKA 活性的變化隨著鹽度上升也呈現出先下降后上升的趨勢，在S15 組NKA 活性最低為1.37 μmol Pi·mg-1prot·h-1(P<0.05)，鹽度0 組其值最高為1.831 37 μmol Pi·mg-1prot·h-1(P<0.05)。

圖4 低鹽脅迫對梭魚幼魚鰓NKA 濃度的影響Fig.4 Effect of low salt stress on gill NKA concentration of L.haematocheila

2.3 梭魚幼魚非特異性免疫酶類對低鹽脅迫的響應

不同鹽度低鹽脅迫對梭魚幼魚SOD 活力的影響如圖5。結果顯示，整體變化趨勢呈現“U”型的規律。超氧化物歧化酶SOD 在鹽度15 組內含量最低為11.56 U·mg-1prot，與S10 組差異不顯著(P＞0.05)，但顯著低于其他各組(P<0.05)。鹽度0 組具有最高的SOD 活性，其值為18.62 U·mg-1prot，為鹽度15 組的1.61 倍。

圖5 低鹽脅迫對梭魚幼魚肝臟SOD 濃度的影響Fig.5 Effect of low salt stress on liver SOD concentration of L.haematocheila

不同鹽度低鹽脅迫對梭魚幼魚CAT 活力的影響如圖6。梭魚幼魚肝臟CAT 濃度在S5、S10、S15 組中差異不顯著(P＞0.05)，S0 和S25 兩組間也不具有顯著差異(P＞0.05)，其最低值位于鹽度15 組為3.81 U·mg-1prot，最高值位于鹽度0 組為4.72 U·mg-1prot，最高值較最低值多了61.07%。

圖6 低鹽脅迫對梭魚幼魚肝臟CAT 濃度的影響Fig.6 Effect of low salt stress on liver CAT concentration of L.haematocheila

不同鹽度低鹽脅迫對梭魚幼魚MDA 活力的影響如圖7，隨著鹽度的上升整體呈現先下降后上升的趨勢，各組間差異均顯著(P<0.05)，其中S15 組中梭魚幼魚MDA 活力最低為0.58 nmol·mg-1prot，僅為S0 組的1/4。

圖7 低鹽脅迫對梭魚幼魚肝臟MDA 濃度的影響Fig.7 Effect of low salt stress on liver MDA concentration of L.haematocheila

不同鹽度低鹽脅迫對梭魚幼魚AKP 活力的影響如圖8，隨著鹽度的升高AKP 活性總體呈現先上升后降低的趨勢，其中S15 組AKP 活性最高為1.69 金氏單位·g-1prot(P<0.05)，而S0 組活性最低為1.12 金氏單位·g-1prot(P<0.05)，最大值為最小值的150.89%。

圖8 低鹽脅迫對梭魚幼魚脾臟AKP 濃度的影響Fig.8 Effect of low salt stress on spleen AKP concentration of L.haematocheila

3 討論

3.1 鹽度對梭魚幼魚生長的影響

鹽度對魚類生長的影響是通過影響魚體能量分配所致。以往研究表明魚類個體需要一定的能量進行滲透壓的調節[9]，生活在等滲環境中中的個體能夠節省這一部分能量用于生長，因此養殖在等滲環境中的魚體會具有較高的增重率和餌料轉化率[10]。本實驗結果表明，鹽度15 組梭魚幼魚具有最高的特定生長率以及最低的餌料系數，推測鹽度15 應該處于梭魚幼魚等滲點附近。這與莫桑比克羅非魚Oreochromis mossambicus[11]、黃錫鯛Sparus sarba[12]及龍虎斑[13]的研究結果基本一致。同時，本研究所得到的這一結果符合KINNE[14]認為大部分近岸魚類體液滲透壓在鹽度10～20 之間的觀點。此外，在本實驗中雖然S0 鹽度組生長受到明顯抑制，但實驗期間該組成活率高達98.7%，這說明梭魚這一廣鹽性魚類對鹽度具有較廣耐受范圍的特性。但稅春等[15]報道梭魚幼魚在鹽度0.8 存活率只有84.00%，推測其實驗結果與其低鹽馴化方式或者養殖時除鹽度外其它環境因子的干擾有關[16]。

3.2 梭魚幼魚滲透調節生理機制對低鹽脅迫的響應

GH，COR，PRL 同為魚類鹽度適應過程中滲透調節的重要激素，本實驗的結果顯示，梭魚幼魚對鹽度變化較為敏感，低鹽脅迫時下丘腦－垂體－腎間組織軸(HPI 軸)及下丘腦-垂體-肝臟生長軸(GH/IGF-I)做出相應的反應，具體表現為GH、COR 隨著鹽度的降低而降低，這與施氏鱘Acipenser schrenckii[17]、斜帶石斑魚Epinephelus coioides[18]的滲透調節激素對鹽度脅迫的相應結果一致，說明GH 和COR 在梭魚幼魚適應鹽度變化時，都表現為高鹽適應激素且具有協同作用。與GH 同為垂體多肽激素的PRL 隨鹽度的降低而升高，表現為低鹽適應激素，與對銀鯧Pampus argenteus[19]的研究結果類似。

NKA 參與細胞內外Na＋/K＋的跨膜主動轉運，提供離子轉運的根本動力，因其在體液和細胞內液之間的滲透壓調節中起到重要的作用，所以可作為判斷魚體離子轉運能力的指標[20]。在本研究中，各鹽度組梭魚幼魚鰓絲NKA 活性隨鹽度的呈“U”型趨勢，在鹽度15 組有最低值，這與對斜帶石斑魚[21]、鯔魚Mugil cephalus[22]、褐牙鲆Paralichthys olivaceus[23]等大多數廣鹽性魚類在等滲點附近NKA 活性最低的研究結果一致。在滲透相關激素的共同作用下，鹽度15～25 范圍內，NKA 活性隨鹽度降低而降低，而S0 組NKA 活性高于對照組，是因為當鹽度降低到一定程度時，NKA 活性會增加以吸收外界環境中的離子來維持體內的滲透壓，余德光等[24]對斜帶石斑魚的研究也存在類似的結果。除此之外，已有研究顯示，細胞消耗總ATP的1/3 用于維持細胞內高K+低Na+的離子環境，而在偏離等滲點鹽度水體的黑鯛幼魚具有高NKA 活性，說明了偏離等滲點鹽度會增加滲透調節所需能量，這與前文中S15 組具有最高的特定生長率以及最低的餌料系數相符合。

3.3 梭魚幼魚抗氧化酶及非特異性免疫酶對低鹽脅迫的響應

鹽度脅迫會引起魚體多種生理應激反應，從而產生氧化應激[25]，肝臟為魚類代謝的主要器官且為儲存多不飽和脂肪酸的重要組織[26]，在已有研究中，魚體抗氧化酶活性的升高，可以顯示魚體內有大量的ROS以待清除[27]。在本實驗中，鹽度0 組梭魚幼魚肝臟SOD 活性顯著升高，表明其在生境鹽度變化的情況下，抗氧化防御系統做出響應，以提高抗氧化酶活性來維持魚體的穩態，這與對褐牙鲆[23]幼魚的研究結果相類似。而CAT 活性隨著鹽度的降低與SOD 有著類似的趨勢。這說明在梭魚幼魚體內抗氧化酶在應對低鹽脅迫時相互協調共同作用，這與對低鹽脅迫下銀鯧[28]的抗氧化酶活性研究結果相類似。在本研究中，鹽度15組的SOD、CAT 活性及MDA 濃度均為最低，這可能與鹽度15 組最接近梭魚幼魚等滲點有關，因此在此鹽度下梭魚幼魚呼吸代謝程度降低，活性氧產生較少，故較低活性的SOD、CAT 及MDA 活性即可維持幼魚健康狀態，這與對多鱗四指馬鲅Eleutheronema rhadinum[29]幼魚的研究相一致。鹽度0 組肝臟SOD、CAT 及MDA 濃度皆為最高，且顯著高于對照組，這說明雖然梭魚幼魚在淡水中仍能存活，但低鹽已對魚體的非特異性免疫造成極大的影響，這也能是S0 組生長受到抑制的內在原因之一。

鹽度變化時，因消耗能量維持內環境穩態，外源性病原會更易侵入魚體，導致爆發疾病的概率增加。堿性磷酸酶AKP 屬魚類非特異性免疫系統，在維持魚體健康穩態中起到重要作用[30]。

本研究結果表明鹽度15 組AKP 活性最高，對照組次之，而更低鹽度組AKP 活性皆受到抑制，且隨著鹽度的降低其AKP 濃度也隨之降低。鹽度15 最接近梭魚幼魚的等滲點，這與低鹽脅迫下梭魚幼魚的生長及攝食情況存在正相關，同時對日本鰻鱺Anguilla japonica[31]、暗紋東方鲀Takifugu obscurus[32]等眾多研究也存在類似的結果。崔前進等[6]對鈍吻黃蓋鰈Pseudopleuronectes yokohamae 低鹽脅迫的研究結果認為，適當降低鹽度可以提升AKP 活性，可以提高魚體免疫力，而鹽度降低到一定程度機體的免疫狀態則會受到抑制，這與本文的研究結果一致。